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豚鼠臟器組織中性粒細胞分離液試劑盒

本品為帶有乳光或微乳光的滅菌水溶液。主要成分是 Ficoll 400 與泛影酸葡甲胺。適用

于從人或各種動物血液或臟器組織中分離中性粒細胞，在醫(yī)療和醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)

用。其他人及動物多種比重細胞分離液。注：因不同種屬不同比重分離液的細胞離散系數(shù)及

細胞帶電不同，所以用戶在定制分離液時應(yīng)提供所需分離液的比重、動物的種屬及被分離細

胞的名稱。

臟器組織分離液試劑盒系列產(chǎn)品目錄

1. 適用于人或各種動物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索

2. 相關(guān)試劑及耗材

3. 注意事項

4. 應(yīng)用

5. 產(chǎn)品性能指標

6. 貯藏及保存期限

7. 實驗前準備

8. 人或各種動物中性粒細胞分離液使用方法說明及圖例

9. 組織單細胞懸液的制備

10. 紅細胞裂解液使用說明

11. 人或各種動物中性粒細胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例

12. 生產(chǎn)企業(yè)

13. 參考文獻

1. 適用于人或各種動物血液及 各種動物血液及 各種動物血液及臟器組織本系列產(chǎn)品檢索：：：：

貨號                     品牌              產(chǎn)品名稱          規(guī)格         報價

2...相關(guān)試劑 2. 相關(guān)試劑及耗材

A．．．． 試劑

貨號 名稱 規(guī)格 價格

2010C1119 全血及組織稀釋液 500ml 400.00

2010X1118 細胞洗滌液 500ml 200.00

Y2013TBD 組織勻漿液 150ml 150.00

NH4CL2009 紅細胞裂解液 100ml 150.00

B．．．． 耗材

貨號 名稱及規(guī)格 生產(chǎn)廠商 價格

3516 6 孔細胞培養(yǎng)板 50 塊/箱 Costar 686.00

3513 12 孔細胞培養(yǎng)板 50 塊/箱 Costar 675.00

3524 24 孔細胞培養(yǎng)板 100 塊/箱 Costar 1287.00

3548 48 孔細胞培養(yǎng)板 100 塊/箱 Costar 1542.00

3599 96 孔細胞培養(yǎng)板 100 塊/箱 Costar 1367.00

430168 25CM 細胞培養(yǎng)瓶(密封蓋) 20 個/包 Corning 113.00

430639 25CM 細胞培養(yǎng)瓶(透氣蓋) 20 個/包 Corning 132.00

430720 75CM 細胞培養(yǎng)瓶(密封蓋) 5 個/包 Corning 56.00

430641 75CM 細胞培養(yǎng)瓶(透氣蓋) 5 個/包 Corning 59.00

430823 150CM 細胞培養(yǎng)瓶(密封蓋) 5 個/包 Corning 102.00

430825 150CM 細胞培養(yǎng)瓶(透氣蓋) 5 個/包 Corning 107.00

431079 175CM 細胞培養(yǎng)瓶(密封蓋) 5 個/包 Corning 133.00

431080 175CM 細胞培養(yǎng)瓶(透氣蓋) 5 個/包 Corning 139.00

431081 225CM 細胞培養(yǎng)瓶(密封蓋) 5 個/包 Corning 167.00

431082 225CM 細胞培養(yǎng)瓶(透氣蓋) 5 個/包 Corning 176.00

430790 15ml 離心管（含泡沫架） 50 支/包 Corning 92.00

430828 50ml 離心管（含泡沫架） 25 支/包 Corning 55.00

430776 250ml 離心管 102 支/箱 Corning 1176.00

4485 1ml 移液管 50 支/包 Costar 55.00

4486 2ml 移液管 50 支/包 Costar 63.00

4487 5ml 移液管 50 支/包 Costar 92.00

430659 2ml 凍存管（可立外旋） 50 支/包 Corning 117.00

430663 5ml 凍存管（可立外旋） 50 支/包 Corning 131.00

GP2012 玻璃吸管 10 支/包 TBD 30.00

GT201210 10ml 玻璃離心管 10 支/包 TBD 90.00

GT201250 50ml 玻璃離心管 5 支/包 TBD 120.00

L147 100/200 目不銹鋼濾網(wǎng) TBD 150.00

3. .. 注意事項 3. 注意事項

A． 本分離液是敏光型的，在運輸和貯藏過程中應(yīng)在 18℃-25℃避光保存，啟封后置 4

℃保存避免微生物污染。另外，本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，

影響分離效果。

B． 待分離的血液、組織及細胞要求新鮮，避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一

定在20℃水浴箱中復(fù)溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時分離效果，

且所有操作過程一定要在無菌條件下進行。

C． 由于各品牌離心機的性能不同，國內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能影響

分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)，調(diào)節(jié)離心的時間，摸索*的分離條件（具體分離條件

各實驗室自定）。

D． 使用無靜電反應(yīng)的離心管，推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。

E． *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素。應(yīng)注意在血液稀釋過程中應(yīng)去除抗凝劑

體積。

F． 分離過程中所用其他試劑如：羥乙一基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細胞洗滌液及

紅細胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇，本公司相關(guān)系列產(chǎn)品無菌、無病毒、無支原體、

低內(nèi)毒素水平且無細胞毒性，所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態(tài)。

4. .. 應(yīng) 用

適用于從人或各種動物血液或臟器組織中分離中性粒細胞。

5.. . . 產(chǎn)品性能指標

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

內(nèi)毒素 ≤0.5...EU/ml

無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清 澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下，，，，

含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下

6.. . . 貯藏及保存期限18℃-25℃避光保存，有效期兩年。啟封后置 4℃保存，有效期一周。

注：：：：若保證無微生物污染，啟封后可置 4℃長期保存。但應(yīng)注意保存溫度較低時本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

7. .. 實驗前準備 7. 實驗前準備

A． 試劑

中性粒細胞分離液(試劑盒所含試劑)、全血及組織稀釋液、細胞洗滌液、紅細胞裂解液、

組織勻漿液、胎牛血清

B． 器材

玻璃離心管、玻璃滴管

水平轉(zhuǎn)子離心機、無菌工作臺

8.. . . 各種動物中性粒細胞分離液 各種動物中性粒細胞分離液 各種動物中性粒細胞分離液使用方法說明及圖例 使用方法說明及圖例

A．取 1ml 新鮮抗凝血，與全血及組織稀釋液 1:1 混勻后小心加于 1 份本分離液之液面上；或取 1ml 組織單細胞懸液（具體制備方法詳見 9.組織單細胞懸液的制備）小心加于 1 份本分離液之液面上；

B. 以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 25 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)。

此時離心管中由上至下細胞分四層。*層；為血漿層。第二層；為環(huán)狀乳白色的單個

核細胞層。第三層；；；；為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層（富集一定量的中性粒細胞 富集一定量的中性粒細胞 富集一定量的中性粒細胞）。。。。第四層；為紅細胞層。棄去*層血漿層及第二層細胞，收集第三層分離液層和第四層紅細胞層 收集第三層分離液層和第四層紅細胞層,放入含細胞洗滌液（Cat#：2010X1118）10ml 的試管中，充分混勻后，以 500g 約（1800 轉(zhuǎn)/分）離心30 分鐘。沉淀經(jīng) 1 次洗滌后用紅細胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解紅細胞，再經(jīng) 3 次洗滌去除紅細胞內(nèi)溶物和碎片后取沉淀細胞即為所需中性粒細胞。

注：A.提取率約為 80%。

注

B. 紅細胞裂解過程詳見“10.紅細胞裂解液使用說明”。

血液（人）中各細胞含量參考值 中各細胞含量參考值 中各細胞含量參考值：：：：

男：4.0-5.5×1012/L(400-550 萬個/mm3)

女：3.5-5.0×1012/L(350-500 萬個/mm3 紅細胞 )

新生兒：6.0-7.0×1012/L(600-700 萬個/mm3)

成人：4.0-10.0×109/L(4000-10000 個/mm3) 白細胞 新生兒：15.0-20.0×109/L（15000-20000 個/mm3) 血小板 100-300×109/L（10 萬-30 萬個/mm3) 名稱 占白細胞總數(shù)百分比 占白細胞總數(shù)百分比 占白細胞總數(shù)百分比 嗜中性粒細胞 30%-70% 嗜酸性粒細胞 0.5%-5% 嗜堿性粒細胞 0%-1% 淋巴細胞 20%-40% 白細胞分類計數(shù)單核細胞 3%-8%

9.. . . 組織單細胞懸液的制備 組織單細胞懸液的制備

注：：：：A.. .. 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法，，，，酶消化法由于各實驗 酶消化法由于各實驗 酶消化法由于各實驗室選取的消化

酶種類各不相同，，，，請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗 請各實驗室自行選擇進行試驗。。。。

B. .. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 B. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境。。。。

剪碎法：：：：將組織塊放入平皿后，加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清；用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購)過濾到試管內(nèi)；離心沉淀 1500轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細胞洗滌液清洗 3次，每次以 500rpm短時低速離心除去細胞碎片，以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾去細胞團塊。作細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為（2～5）×107個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108-1×109個/ml 的單細胞懸液備用。 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nèi)，加入 2ml 組織勻漿液及 20% 勻漿器法胎牛血清；緩慢轉(zhuǎn)動研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器；收集細胞懸液，經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購）過濾；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細胞洗滌液洗 3 次，離心沉淀。作細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為（2～5）×107 個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108-1×109個/ml 的單細胞懸液備用。 細胞計數(shù)方法: 細胞計數(shù)法是用來計數(shù)細胞懸液中細胞數(shù)量的一種方法。一般利用計數(shù)板（血球計數(shù)板）進行。既可用于分離（散）細胞培養(yǎng)接種前計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，也可用于對培養(yǎng)物的細胞數(shù)量進行計數(shù)。不論計數(shù)的對象如何，均須制備分散的細胞懸液。

計數(shù)與計算過程

1）、在細胞計數(shù)板中央放置計數(shù)的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計數(shù)板凹蹧處流出懸液，至

蓋玻片被液體充滿為止。

3）、置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內(nèi)的細胞總數(shù)。對于壓線的細胞只計數(shù)在上線和左線者，

對于細胞團按單個細胞計數(shù)。

4）、按下式計數(shù)細胞懸液的密度：

細胞密度＝（4 個大格細胞總數(shù)/4）×104個/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1m（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3細胞計數(shù)要點： 細胞計數(shù)要點：：：

A． 進行細胞計數(shù)時，要求懸液中細胞數(shù)目不低于 104個/ml，如果細胞數(shù)目很少要進行離

心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計數(shù)時，遇到 2 個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算。如果細胞團>10％，說明細胞分散不充分; 或細胞數(shù)<200 個/10mm2或>500 個/10 mm2 時，說明稀釋不當，需重新制備細胞懸液。

B． 要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性。

C． 取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細胞懸液，尤其是多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混

勻，以求計數(shù)準確；

D． 數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細

胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計左線，不計右線。

E． 操作時，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯誤： 初學(xué)者易犯的錯誤：：：

A． 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。

B． 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C． 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

10.. . . 紅細胞裂解液使用說明 紅細胞裂解液使用說明

本裂解液有別于市場 本裂解液有別于市場上銷售的其它紅細胞裂解液，，，，其配方經(jīng)過本公司優(yōu)化在裂解紅細 其配方經(jīng)過本公司優(yōu)化在裂解紅細胞的同時不損傷并在一定程度上保護淋巴細胞(lymphocyte) 胞的同時不損傷并在一定程度上保護淋巴細胞(lymphocyte) (lymphocyte)或其它有細胞核的細胞 或其它有細胞核的細胞 或其它有細胞核的細胞，，，，所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態(tài) 得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態(tài)。。。。另外，，，，本裂解液中無DNA及RNA酶，，，，配合細胞分離液使用所提細胞可廣泛用于細胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)實驗， 合細胞分離液使用所提細胞可廣泛用于細胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)實驗，，，請廣大用戶從優(yōu)選擇 請廣大用戶從優(yōu)選擇 請廣大用戶從優(yōu)選擇。。。。 紅細胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也稱ACK Lysis Buffer，是一種用于

從人或鼠等的血液或組織細胞樣品中裂解并去除無細胞核紅細胞的溶液。 本裂解液不適用于有細胞核紅細胞的裂解，例如鳥或禽類的紅細胞。本裂解液經(jīng)過無菌處理，處理過的血液或組織細胞樣品可以用于后續(xù)的原代培養(yǎng)、細胞融合以及核酸或蛋白的

提取及各種常規(guī)的分析和檢測。

使用說明：：：：

A. .. 對于組織細胞樣品 A. 對于組織細胞樣品 對于組織細胞樣品：：：：

a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當方法分散成細胞懸液，離心棄上清。

b. 加入3-5倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細胞沉淀的體

積為1ml，則加入3-5ml的紅細胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不

會影響后續(xù)的一些檢測。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心

2-3分鐘，棄上清?？稍僦貜?fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

B. .. 對于組織細胞樣品無需洗滌的快速操作步驟 B. 對于組織細胞樣品無需洗滌的快速操作步驟 對于組織細胞樣品無需洗滌的快速操作步驟：：：：

a. 新鮮組織經(jīng)過膠原酶或胰酶等消化處理，通過適當方法分散成細胞懸液，離心棄上清。

b. 對于0.2ml細胞沉淀加入1ml紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。本步驟在室溫 或4度操作均可。

c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，混勻。

d. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

e. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不 會影響后續(xù)的一些檢測。

f. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

注：：：：對于常規(guī)步驟，多一步洗滌過程中的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也 更好一些，同時不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同 時需要大體積的離心管。

C. .. 對于血液樣品 C. 對于血液樣品：：：：

a. 取新鮮抗凝血，400-500g離心5分鐘，離心棄上清。

b. 加入6-10倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細胞沉淀的體 積為1ml，則加入6-10ml的紅細胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。注意：對于鼠 的血液，裂解1-2分鐘已經(jīng)足夠，對于人的外周血，宜延長裂解時間至4-5分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不 會影響后續(xù)的一些檢測。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心 2-3分鐘，棄上清。可再重復(fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

注：：：：對于微量或少量的血液樣品，可以在*步中不進行離心棄上清的操作，直接在第二步 中加入10倍血液體積的紅細胞裂解液，并在室溫或4℃裂解4-5分鐘。對于鼠的血液，裂解4-5 分鐘已經(jīng)足夠，對于人的外周血，宜延長裂解時間至10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且 裂解過程中宜適當偶爾搖動以促進紅細胞裂解。后續(xù)步驟相同。

D. .. 對于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟 D. 對于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟 對于血液樣品無需洗滌的快速操作步驟：：：：

a. 每1ml新鮮抗凝血中加入10ml紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解4-5分鐘。本步驟在室 溫或4度操作均可。注意：對于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對于人的外周血，宜 延長裂解時間至10分鐘，但通常不宜超過15分鐘，并且裂解過程中宜適當偶爾搖動以促 進紅細胞裂解。

b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，混勻。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細胞不 會影響后續(xù)的一些檢測。

e. 根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀后即可進行計數(shù)等后續(xù)實驗。

注：：：：對于常規(guī)步驟，多一步洗滌過程的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更 好一些，同時不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時 需要大體積的離心管。

11.. . . 人或各種動物中性粒細胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例 各種動物中性粒細胞分離液試劑盒使用方法說明及圖例

Store at：：：RT 試劑盒規(guī)格：：：：2×100ml/Kit

試劑盒內(nèi)容：全血及組織稀釋液 100ml

細胞洗滌液 100ml

試劑 A 2×100ml

紅細胞裂解液 100ml

說明書 1 份

操作方法：：：：

A．取 1ml 新鮮抗凝血，與全血及組織稀釋液 1:1 混勻后小心加于 1 份 A 液之液面上；或取

1ml 組織單細胞懸液（具體制備方法詳見 9.組織單細胞懸液的制備）小心加于 1 份 A 液

之液面上；

B. 以 500g（約 1800 轉(zhuǎn)/分）離心 25 分鐘(半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子)。

此時離心管中由上至下細胞分四層。*層；為血漿層。第二層；為環(huán)狀乳白色的單個

核細胞層。第三層；；；；為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層 為略帶混濁的分離液層（富集一定量的中性粒細胞 富集一定量的中性粒細胞 富集一定量的中性粒細胞）。。。。第四層；為紅細胞層。棄去*層血漿層及第二層細胞，收集第三層分離液層和第四層紅細胞層 收集第三層分離液層和第四層紅細胞層,放入含細胞洗滌液（Cat#：2010X1118）10ml 的試管中，充分混勻后，以 500g 約（1800 轉(zhuǎn)/分）離心30 分鐘。沉淀經(jīng) 1 次洗滌后用紅細胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解紅細胞，再經(jīng) 3 次洗滌去除紅細胞內(nèi)溶物和碎片后取沉淀細胞即為所需中性粒細胞。

注：A.提取率約為 80%。 注

B. 紅細胞裂解過程詳見“10.紅細胞裂解液使用說明”。

13. . . . 參考文獻

［1］ Meier C, Middelanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after perinatal

brain damage in rats Is reduced by human cord blood mononuclear cells［J］. Pediatric

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［3］ 程范軍,鄒 萍,楊漢東,等.人臍血間充質(zhì)干/ 祖細胞誘導(dǎo)為心肌樣細胞的實驗研究［J］.

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案例分析：人乙肝表面抗原（HBsAg）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定相關(guān)液體樣本中乙肝表面抗原（HBsAg）的含量。

實驗原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人乙肝表面抗原（HBsAg）水平。用純化的人乙肝表面抗原（HBsAg）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入乙肝表面抗原（HBsAg），再與HRP標記的乙肝表面抗原（HBsAg）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人乙肝表面抗原（HBsAg）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人乙肝表面抗原（HBsAg）濃度。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?/span>2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.       標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔，在*、第二孔中分別加標準品100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為90 IU/L,60 IU/L ,30 IU/L, 15 IU/L, 7.5 IU/L）。

2.       加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3.       溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

4.       配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。

5.       洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

6.       加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.       溫育：操作同3。

8.       洗滌：操作同5。

9.       顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10.    終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.    測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

注意事項：

1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2． 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6． 底物請避光保存。

7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9． 本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，   

在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD     

值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋      

倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標      

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值      

代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋      

倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。                  

（此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。

2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和11%

檢測范圍：                                             

5IU/L -100IU/L                                       

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個月