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氨芐青霉素快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氨芐青霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氨芐青霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氨芐青霉素的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物氨芐青霉素的含量。

二、試劑盒特性

試劑盒靈敏度：   0.1ppb

孵育溫度：       25℃

孵育時間：       30min～30min～15min

樣本檢測下限

組織、蜂蜜、牛奶                     2ppb

蜂蜜、牛奶樣本因存在一定的干擾，定量檢測下限為4ppb

u交叉反應(yīng)率

氨芐青霉素                           100%

青 霉 素                              0.8%

鄰氯青霉素                            0.2%

雙氯青霉素                            0.1%

阿莫西林                              0.1%

頭孢塞呋                              0.1%

樣本回收率

組  織                               75±19%

蜂蜜 、牛奶                          70±17%

三、試劑盒組成

1、微量測試孔：每條8孔，一板12條

2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶（1ml/瓶）： 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、酶標(biāo)記物    12ml                 紅色帽

4、抗體工作液  7ml                  藍色帽

5、底物A液   7ml                   白色帽

6、底物B液   7ml                   黑色帽

7、終止液     7ml                   黃色帽

8、20X濃縮洗滌液   40ml            白色帽

9、5X濃縮復(fù)溶液    50ml            透明帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、刻度移液管

微量移液器：單道 20µl～200µl、單道100µl～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：氫氧化鈉、乙腈、正己烷、亞硝基鐵氰化na、硫酸鋅

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理需配制：

配液1   C液（牛奶、奶粉樣本）：

 10.7g 亞硝基鐵氰化na加去離子水100ml溶解。

配液2   D液（牛奶、奶粉樣本）：

28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解。

配液3  0.1M NaOH溶液

0.4gNaOH加去離子水100ml溶解。

配液4  乙腈-0.1M NaOH溶液

84ml乙腈16ml 0.1M NaOH混合均勻

配液5  樣本復(fù)溶液：

將5X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：4稀釋。

配液6  1M NaOH溶液

        4g NaOH加去離子水100ml溶解

樣本處理：

（a）組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)樣本處理方法

1、稱取2±0.05g均質(zhì)后樣本于50ml離心管中，加入2ml 1M NaOH溶液，渦旋2min，再加入8ml乙腈振蕩5min，室溫4000r/min以上離心10min；

2、取出1ml上清液，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥；

3、加入1 ml樣本復(fù)溶液溶解干燥殘留物，混合30s；將溶解后的樣本液按1：3（50µl樣本液加150µl樣本復(fù)溶液）稀釋，混合30s；

4、取50 µl用于分析

樣本稀釋倍數(shù):  20倍

（b）蜂蜜處理方法

1、準(zhǔn)確稱取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入3ml 樣本復(fù)溶液，振蕩混勻后靜置20min；室溫4000r/min 以上離心10min；

2、取上層液體用樣本復(fù)溶液按1：4（20µl樣本液+80µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；

3、取50µl用于分析

樣本稀釋倍數(shù):  20倍

（c） 牛奶樣本處理方法一

1、取2ml鮮牛奶于5ml離心管，加入50µlC液混勻；

2、加入50 µl D液振蕩1min，10℃ 4000r/min以上離心10min；

3、取上層清亮液體用樣本復(fù)溶液按1： 19（20µl樣本液+380µl樣本復(fù)溶液）稀釋，混合30s；

4、取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20

注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。

（d）牛奶樣本處理方法二

1、取2ml去除脂肪奶樣至離心管中；

2、加入8ml乙腈-0.1M NaOH充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min，取1ml上清液，在56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥；

3、用1ml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入1ml樣本復(fù)溶液混合30s，離心去除正己烷相；

4、取下層相用樣本復(fù)溶液按1：3 （50µl樣本液加150µl稀釋后的復(fù)溶液）稀釋，混合30s；

5、取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  20倍

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

u測定前應(yīng)須知：

1、使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。

3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟：

1、從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、配液：將40ml 20X濃縮洗滌液用去離子水稀釋至800ml。

4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

6、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

9、測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含氨芐青霉素量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816；0.3ppb為1.415；0.9ppb為0.74；2.7ppb為0.313；8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氨芐青霉素實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝ B ×100%

 B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氨芐青霉素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。八、 注意事項

1、室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、該試劑盒理想反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

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