EASYspin 組織/細胞 RNA 快速提取試劑盒
EASYspin RNA Rapid Tissue and cell Kit
保存條件:本試劑盒在室溫儲存 12 個月不影響使用效果。
產(chǎn)品介紹:
*的裂解液/β-巰基乙醇迅速裂解細胞和滅活細胞 RNA 酶,然后用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后,RNA 在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜, 再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物,蛋白等雜質(zhì)去除,最后低鹽的 RNase free H20 將純凈 RNA 從硅基質(zhì)膜上洗脫。
自備試劑:乙醇, β-巰基乙醇注意事項:
1.需要自備一次性注射器,研缽。RA105 EASYspin 組織 細胞RNA快速提取試劑盒
-MBI2.裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作時要戴乳膠手套,避免沾染皮膚,眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時,要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
3.關(guān)于DNA 的微量殘留:
一般說來任何總RNA 提取試劑在提取過程中無法*避免DNA 的微量殘留,本公司的EASYspin 系列RNA 提取產(chǎn)品,在大多數(shù) RT-PCR 擴增過程中極其微量的DNA 殘留(一般電泳 EB 染色紫外燈下觀察不可見)影響不是很大, 如果要進行嚴格的
mRNA 表達量分析如熒光定量 PCR,我們建議在進行模板和引物的選擇時:
1) 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過 mRNA 中的連接區(qū),這樣 DNA 就不能作為模板參與擴增反應(yīng)。
2) 選擇基因組DNA 和 cDNA 上擴增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對。
操作步驟:
ð *次使用前請先在漂洗液 RW 瓶和 70%乙醇瓶中加入量無水乙醇!
ð 操作前在裂解液RLT 中加入β-巰基乙醇至終濃度 1%,如 1 ml RLT 中加入 10μl β-
巰基乙醇。此裂解液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的 RLT 4℃可放置一個月。
1. 組織培養(yǎng)細胞
a. 收集<107 懸浮細胞到一個 1.5ml 離心管,對于貼壁細胞,孔板培養(yǎng)可以直接裂解, 細胞瓶培養(yǎng)應(yīng)該先用胰蛋白酶消化后吹打下來收集。
b. 2,000rpm 離心 10 sec(或者 300g 離心 5 min),使細胞沉淀下來。*吸棄上清,留下細胞團,注意不*棄上清會稀釋裂解液導致產(chǎn)量純度降低。
c. 輕彈管壁將細胞沉淀*松散重懸, 加入 350μl(<5x106 細胞) 或者 600μl
(5x106-1x107 細胞)裂解液RLT,吹打混勻后用手劇烈振蕩 20 sec,充分裂解。
d. 用帶鈍針頭的一次性 1ml(配 0.9mm 針頭) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動勻漿 30 sec),可以剪切 DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。
e. 接操作步驟項下 3。
2. 動物組織(例如鼠肝腦)
a. 電動勻漿: 新鮮組織用解剖刀迅速切成小碎塊, 加入 350μl(<20mg 組織) 或者
600μl(20-30mg 組織)的裂解液RLT 后電動*勻漿 20-40 sec。
b. 液氮研磨+勻漿:在液氮中研磨組織成細粉后,取適量組織細粉(20mg/30mg)轉(zhuǎn)入 裝有 350μl/600μl 組織裂解液 RLT 的 1.5ml 離心管中, 用手劇烈振蕩 20 sec,充分裂解。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配 0.9mm 針頭) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動勻漿30 sec),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高產(chǎn)量。
c. 將勻漿后裂解物 12,000rpm 離心 3 min,沉淀可能存在的裂解困難的碎片或者不溶物,
將裂解物上清小心轉(zhuǎn)到一個新離心管。
d. 接操作步驟項下 3。
3. 較精確估計裂解物(上清)體積,加入等體積的 70%乙醇(請先檢查是否已加入無水乙醇!),此時可能出現(xiàn)沉淀,但是不影響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。
4. 立刻將混合物(每次小于 700μl,多可以分兩次加入)加入一個吸附柱 RA 中,(吸附柱放入收集管中)12,000rpm 離心 60 sec,棄掉廢液。
5. 加 350μl 去蛋白液 RW1,室溫放置 30 sec,12,000rpm 離心 30 sec,棄掉廢液。將吸附柱 RA 放回收集管中。
6. DNaseI 工作液的配制:取 10μl DNaseI 儲存液放入新的 RNase-free 離心管中,加入
70μl RDD 溶液,輕柔混勻。
7. 向吸附柱 RA 中央加入 80μl DNaseI 工作液,室溫放置 15 min(一般情況下室溫放置可得到較好的消化效果,如果室溫效果不佳可選擇在 37℃放置 15 min)。
8. 加 350μl 去蛋白液 RW1,室溫放置 30 sec,12,000rpm 離心 30 sec,棄掉廢液。將吸附柱 RA 放回收集管中。
9. 加入 500μl 漂洗液 RW(請先檢查是否已加入無水乙醇!),12,000rpm 離心 30 sec,棄掉廢液。加入 500μl 漂洗液 RW,重復一遍。
10. 將吸附柱 RA 放回空收集管中,12,000rpm 離心 2 min,將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘,以*晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11. 取出吸附柱 RA,放入一個 RNase free 離心管中,根據(jù)預期 RNA 產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free wate(r 事先在65℃水浴中加熱效果更好),室溫放置1 min,12,000rpm 離心 1 min。