NF-KB p65活性檢測實驗
核轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB (NF-kB) 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種與炎癥、抗凋亡、
腫瘤形成和轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因表達。NF- kappaB (NF _kB)初被鑒定為在B細胞中和免疫球蛋白k輕鏈的增強子結(jié)合。但隨后在非B-細胞的細胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)，形成NF-KB和kB的復(fù)合物。初在DNA結(jié)合蛋白復(fù)臺物中分離的NF -kB是由p65(ReIA)和p50構(gòu)成的異源雙聚體。其他分離的單體包括p49 (也可稱為p52) , p75 (C-Rel) ,p68(ReIB)。 p65,p68，p75單體起反式激活作用。p50, p49 (p52) 單體具有DNA結(jié)合活力，但只具有微量的反式激活作用。據(jù)報道p49和NF-kB的單體p65形成具有轉(zhuǎn)錄活力的異源雙體，類似于p50/ p65異源雙體。p49/ p65和p50/ p65異源雙體在細胞質(zhì)中受一種叫kBa/MAD-3的抑制劑調(diào)節(jié)。
IkB和p65單體結(jié)合，阻制了細胞核中的定位和DNA的結(jié)合。在體外高濃度的p65能形成同源雙聚體，能和DNA微弱地結(jié)合。Poly(dl:dC)能抑制這一 反應(yīng) 。p49和p50也能形 成同源雙聚體，但在細胞中的濃度很低。通常,在作NF-KB的凝膠遷移實驗時,在20ul的反應(yīng)體積中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles的NF -kB9寡核苷酸(pH7.9), 50mMKCI, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油，0.05%NP-40。當(dāng)用純化的蛋白時，250-300ng足以形成凝膠遷移復(fù)合物， 而需用10ug的Hel a細胞核抽提物。凝膠遷移復(fù)合物在室溫中保溫30分鐘，在50mMTris(pH8 3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離凝膠遷移復(fù)合物。含考馬斯蘭和二甲苯藍色素的加樣溶液只能加入到陰性對照反應(yīng)中，因這兩種色素會加劇NF-kB復(fù)合物的解離。當(dāng)用Hel a細胞核抽提物作為結(jié)合蛋白來源時，可形成兩種序列特異的凝膠遷移復(fù)合物，即p50/p50同源雙聚體和p50/ p65異源雙聚體。在表達p49，p50, p65的細胞中， 可檢測到4個序例特異的凝膠遷移復(fù)合物(p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65)，如果存在高濃度的p65，可檢測到微量的p65/p65.
下列試劑可加強NF- kB在體外的結(jié)合: mM的GTP, ATP, 精胺，亞精胺,鋇或鈣離子，ng的
Co+3(NH3)6 (12) 。提取組織或細胞核蛋白，利用不同形式的NF -Kb p65抗體捕獲細胞核蛋白并加以區(qū)分,通過酶標(biāo)儀450nm處測定核蛋白標(biāo)準(zhǔn)品與NF -Kb p65吸光度值，進行定量比較,從而明確目的蛋白的活化度。
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