狗臟器組織單個核細胞分離液
為帶有乳光或微乳光的滅菌水溶液。主要成分是 Ficoll 400 與泛影酸葡甲胺。適用
于從血液或組織中分離單個核細胞,在醫(yī)療和醫(yī)學生物學研究中廣泛應用。
其他人及動物多種比重細胞分離液。注:因不同種屬不同比重分離液的細胞離散系數(shù)及
細胞帶電不同,所以用戶在定制分離液時應提供所需分離液的比重、動物的種屬及被分離細
胞的名稱。
狗臟器組織分離液產(chǎn)品目錄
1. 適用于各種動物血液及組織本系列產(chǎn)品檢索
2. 相關試劑及耗材
3. 注意事項
4. 應用
5. 產(chǎn)品性能指標
6. 貯藏及保存期限
7. 實驗前準備
8. 使用方法說明及圖例
8.1 血液樣本分離液使用說明及圖例
8.2 組織分離液使用說明及圖例
9. HES-TBD550 使用說明
10. 組織單細胞懸液的制備
11. 生產(chǎn)企業(yè)
12. 參考文獻
1. 適用于各種動物血液及組織 于各種動物血液及組織本系列產(chǎn)品檢索:::
貨號 品牌 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 報價
WBC1085Z | TBD | 豚鼠腫瘤浸潤組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1090C | TBD | 雞外周血白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1090CP | TBD | 雞臟器組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1078H | TBD | 猴外周血白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1078HP | TBD | 猴臟器組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1078HZ | TBD | 猴腫瘤浸潤組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1110 | TBD | 豬外周血白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1110P | TBD | 豬臟器組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1110C | TBD | 豬腸黏膜組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1110Z | TBD | 豬腫瘤浸潤組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1094 | TBD | 馬外周血白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1094P | TBD | 馬臟器組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1094Z | TBD | 馬腫瘤浸潤組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1087 | TBD | 羊外周血白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1087P | TBD | 羊臟器組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1087Z | TBD | 羊腫瘤浸潤組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1080F | TBD | 魚全血白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
WBC1080FZ | TBD | 魚組織白細胞分離液試劑盒 | 100ml | 600 |
3. 注意事項
A. 本分離液是敏光型的,在運輸和貯藏過程中應在 18℃-25℃避光保存,啟封后置 4
℃保存避免微生物污染。另外,本品為真空包裝,未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結晶,
影響分離效果。
B. 待分離的血液、組織及細胞要求新鮮,避免冷凍和冷藏。分離液和所分離樣本一
定在20℃水浴箱中復溫20分鐘保證分離液和所分離樣本溫度在20℃±2℃時分離效果,
且所有操作過程一定要在無菌條件下進行。
C. 由于各品牌離心機的性能不同,國內南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異,可能影響
分離效果,用戶可以調節(jié)離心轉數(shù),調節(jié)離心的時間,摸索*的分離條件(具體分離條件
各實驗室自定)。
D. 使用無靜電反應的離心管,推薦使用未經(jīng)過堿處理的玻璃離心管。
E. *抗凝劑選擇:EDTA、枸櫞酸、肝素。應注意在血液稀釋過程中應去除抗凝劑
體積。
F. 分離過程中所用其他試劑如:羥乙已基淀粉 550、全血及組織稀釋液、細胞洗滌液及
紅細胞裂解液等以我公司產(chǎn)品為*選擇,本公司相關系列產(chǎn)品無菌、無病毒、無支原體、
低內毒素水平且無細胞毒性,所獲得的細胞可保持完好的生物活性和完整的細胞形態(tài)。
4. 應. 用
適用于從各種動物血液或組織中分離單個核細胞。
5.. . . 產(chǎn)品性能指標
pH 7.0-7.5
滲透壓 280-340mOsmol/kg
內毒素 ≤0.5...EU/ml
無菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清
澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下,,,含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下
6.. . . 貯藏及保存期限 貯藏及保存期限
18℃-25℃避光保存,有效期兩年。啟封后置 4℃保存,有效期一周。
注::::若保證無微生物污染,啟封后可置 4℃長期保存。但應注意保存溫度較低時本分離液易出現(xiàn)白色結晶,影響分離效果。
7. 實驗材料 7. 實驗材料
A. 試劑
單個核細胞分離液、全血及組織稀釋液、細胞洗滌液、羥乙已基淀粉 550、胎牛血清
B. 器材
玻璃離心管、玻璃滴管水平轉子離心機、無菌工作臺
8.. . . 使用方法說明及圖例 使用方法說明及圖例
8.1. 血液樣本分離液使用說明及圖例
A. 小量分離 A. 小量分離-使用 1-2ml 新鮮抗凝血(分離圖例見圖例 (分離圖例見圖例 1)::
a. 取新鮮抗凝血 1-2ml,與全血及組織稀釋液(Cat#:2010C1119)1:1 混勻;
b. 小心加于與混合液等體積的細胞分離液之液面上;
c. 以 400g(約 1500 轉/分)離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉子);
此時離心管中由上至下細胞分為四層。*層;為血漿層。第二層;;;為環(huán)狀乳白色 ;為環(huán)狀乳白色單個核細胞層。。。。第三層;為透明分離液層。第四層;為紅細胞層。收集第二層細胞放入含 4-5ml細胞洗滌液(Cat#:2010X1118)的試管中,充分混勻后,以 500g(約 1800 轉/分)離心 20分鐘,棄去上清留沉淀細胞重新懸起。重復洗滌 2 次即得所需細胞。
B. 中量分離 B. 中量分離-使用 5-10ml 新鮮抗凝血(分離圖例見圖例 (分離圖例見圖例 1)::
a. 取新鮮抗凝血 5-10ml,與全血及組織稀釋液(Cat#:2010C1119)1:1 混勻;
b. 將混合液小心疊加于細胞分離液之液面上(混合液:::分離液 :=2==:=:::1);
c. 以 500g(約 1800 轉/分)離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉子);
此時離心管中由上至下細胞分為四層。*層;為血漿層。第二層;;;為環(huán)狀乳白色 ;為環(huán)狀乳白色單個核細胞層。。。。第三層;為透明分離液層。第四層;為紅細胞層。收集第二層細胞放入含 10ml細胞洗滌液(Cat#:2010X1118)的試管中,充分混勻后,以 500g(約 1800 轉/分)離心 20分鐘,棄去上清留沉淀細胞重新懸起。重復洗滌 2 次即得所需細胞。
C. 大量分離 C. 大量分離 I-使用 20ml 新鮮抗凝血(分離圖例見圖例 (分離圖例見圖例 2)::
a. 取新鮮抗凝血 20ml 以 200g(約 1100 轉/分)離心 20 分鐘棄去血漿;
b. 向棄去血漿的血細胞 棄去血漿的血細胞中加入全血及組織稀釋液(Cat#:2010C1119)12ml 小心混勻;
c. 將混合液小心疊加于細胞分離液之液面上(混合液:::分離液 :=2==:=:::1);
d. 以 600g(約 2000 轉/分)離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉子);
此時離心管中由上至下細胞分為四層。*層;為血漿層。第二層;;;為環(huán)狀乳白色 ;為環(huán)狀乳白色單個
核細胞層。。。。第三層;為透明分離液層。第四層;為紅細胞層。收集第二層細胞放入含 20ml
細胞洗滌液(Cat#:2010X1118)的試管中,充分混勻后,以 500g(約 1800 轉/分)離心 20分鐘,棄去上清留沉淀細胞重新懸起。重復洗滌 2 次即得所需細胞。
D. 大量分離 D. 大量分離 II-使用 50ml 新鮮抗凝血(分離圖例見圖例 (分離圖例見圖例 3)::
a. 取新鮮抗凝血50ml 與 HES 50ml HES----TBD550 液 1:1 混合后再與 1 份注射用生理鹽水混勻 20℃-30
℃靜置 20-30 分鐘。吸取混濁的上清液備用,棄去底部紅細胞。
b. 將步驟 1 中留取的上清液以 200g(約 1100 轉/分)離心 20 分鐘棄去上清保留沉淀細
胞;
c. 向沉淀的細胞中加入全血及組織稀釋液(Cat#:2010C1119)20ml 小心混勻;
d. 將混合液小心疊加于細胞分離液之液面上(混合液:::分離液 :=2==:=:::1);
e. 以 600g(約 2000 轉/分)離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉子);
此時離心管中由上至下細胞分為四層。*層;為血漿層。第二層;;;為環(huán)狀乳白色 ;為環(huán)狀乳白色單個
核細胞層。。。。第三層;為透明分離液層。第四層;為紅細胞層。收集第二層細胞放入含 20ml
細胞洗滌液(Cat#:2010X1118)的試管中,充分混勻后,以 500g(約 1800 轉/分)離心 20
分鐘,棄去上清留沉淀細胞重新懸起。重復洗滌 2 次即得所需細胞。
注::::提取率約為 80%。。。。
血液(人)中各細胞含量參考值 中各細胞含量參考值::: :
男:4.0-5.5×1012/L(400-550 萬個/mm3
)
女:3.5-5.0×1012/L(350-500 萬個/mm3 紅細胞 )
新生兒:6.0-7.0×1012/L(600-700 萬個/mm3
)
成人:4.0-10.0×109
/L(4000-10000 個/mm3
) 白細胞 新生兒:15.0-20.0×109
/L(15000-20000 個/mm3
)
血小板 100-300×109
/L(10 萬-30 萬個/mm3
)
名稱 占白細胞總數(shù)百分比 占白細胞總數(shù)百分比
嗜中性粒細胞 30%-70%
嗜酸性粒細胞 0.5%-5%
嗜堿性粒細胞 0%-1%
淋巴細胞 20%-40%
白細胞分
類計數(shù)
單核細胞 3%-8%
分離圖例 3
抗凝血 50ml 與 HES-TBD550 1:1 混合后再與 1 份注射用生理鹽水混勻 20℃-30℃靜置 20-30 分鐘
8.2 組織分離液使用說明及圖例 8.2 組織分離液使用說明及圖例
A.取組織勻漿單細胞懸液(細胞濃度為 2×108
-1×109個/ml,具體制備方法參照“10.組織
單細胞懸液的制備”)2ml,小心加于 2ml 細胞分離液之液面上;
B.以 400g(約 1500 轉/分)離心 15 分鐘(半徑 15cm 水平轉子);
此時離心管中由上至下細胞分為四層。*層;為胎牛血清液層。第二層;;;為環(huán)狀乳白色 ;為環(huán)狀乳白色單
個核細胞層。。。第三層;為透明分離液層。第四層;為紅細胞層。收集第二層細胞放入含 4-5ml
細胞洗滌液(Cat#:2010X1118)的試管中,充分混勻后,以 500g(約 1800 轉/分)離心 20
分鐘,棄去上清留沉淀細胞重新懸起。重復洗滌 2 次即得所需細胞。
9. HES. . HES-TBD550 使用說明
HES 是從支鏈淀粉衍生出來的,是富含淀粉的復合物,其生理和化學特性主要由羥乙已基
取代度即取代級、平均分子量決定。大量實驗表明平均分子量越大對紅細胞的凝集作用越強,
有效提高紅細胞的沉降速度,從而使紅細胞與其它細胞分離。故而,使用 HES-TBD550(羥
乙已基淀粉 550)沉淀法是一種高效的細胞分離方法。
間充質干細胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨細胞、成脂肪細胞、
骨髓基質細胞、肝臟細胞、心肌細胞和神經(jīng)細胞等多種細胞分化的多潛能組織干細胞,是在
細胞治療、基因治療中有效發(fā)揮作用的理想工程細胞。MSCs 不僅存在于骨髓,也可從臍血、
外周血中以及脂肪組織、肌肉、胎兒器官、大腦、牙齒中分離。UCB - MSCs 的分離、篩選、
增殖、分化與臍血樣本的選擇、培養(yǎng)基的差異以及分離、擴增分化過程中操作技術等多種因
素有關。目前用于 UCB - MSCs 分離的方法有:貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀
法和免疫磁珠法。流式細胞儀法對細胞損傷較大,免疫磁珠法價格相對較貴且由于抗原抗體
反應也容易改變細胞原有特性,而 HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)聯(lián)合密度梯度離心法常與貼壁篩選法結合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的純度,目前研究多采用此法。國內不少學者采用羥乙已基淀粉沉淀紅細胞,然后再進行離心分離單個核細胞,也取得不錯結果。實驗證明采用隨機數(shù)字表法,將每份臍血隨機分入兩個不同處理組,從而將臍血樣本的個體差異減小到zui小程度。結果證實,HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)聯(lián)合密度梯度離心法獲得的有核細胞數(shù)量明顯多于 FICOLL 密度梯度離心法。本實驗采用的羥乙已基淀粉商品名為
HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550),克分子滲透壓為 308mosm/L,膠體滲透壓為 68/36 mmHg,可影響紅細胞集聚性沉降率。紅細胞集聚是可遞性橋接結構形成的結果,由大的 HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)分子處在紅細胞之間聯(lián)接而成。HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)同時還阻礙白細胞和內皮細胞的黏附,并使平均血小板容積呈現(xiàn)微弱地降低,從而有輕度抑制血小板集聚的功能。臍血經(jīng) HES-TBD550(羥乙已基淀粉 550)處理后,可使紅細胞沉積至試管底,對其它主要成分包括干細胞無影響。經(jīng)這樣處理后,實驗時間相對較短(平均為 1.5 h),步驟相對較少,細胞污染幾率小,從而使細胞數(shù)損失減少。結論證明,與相應的干細胞分離液聯(lián)合分離使用羥乙已基淀粉沉淀法是一種高效的臍血干細胞分離方法。
10.. . . 組織單細胞懸液的制備 組織單細胞懸液的制備
注::::A.. .. 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法 本說明只提供機械勻漿制備單細胞懸液的方法,,,酶消化法由于各實驗室選取的消 ,酶消化法由于各實驗室選取的消
化酶種類各不相同,,,,請各實驗室自行選擇進行試驗B.. .. 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境 全過程及所需試劑要求無菌環(huán)境。。。
剪碎法:::將組織塊放入平皿后 : ,加入少量組織勻漿液及 20%胎牛血清;用眼科剪將組織剪至勻漿狀,加入 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清;用吸管吸取組織勻漿,用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購)過濾到試管內;離心沉淀1500轉/分×3 min,再用細胞洗滌液清洗3次,每次以500rpm短時低速離心除去細胞碎片,以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購)過濾去細胞團塊。作細胞計數(shù)并調整細胞濃度為(2~5)×107個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108-1×109個/ml 的單細胞懸液備用。 勻漿器法:用眼科剪將組織剪成小塊;放入 70ml 組織研磨器內,加入 2ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清;緩慢轉動研棒,研磨至勻漿;用 5ml 組織勻漿液及 20%胎牛血清沖洗研器;收集細胞懸液,經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)(另購)過濾;離心沉淀 800rpm×2min ,再用細胞洗滌液洗 3 次,離心沉淀。作細胞計數(shù)并調整細胞濃度為(2~5)×107個/ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用 20%胎牛血清或全血及組織稀釋液懸起細胞濃度為 2×108-1×109 個/ml 的單細胞懸液備用。
細胞計數(shù)方法: 細胞計數(shù)法是用來計數(shù)細胞懸液中細胞數(shù)量的一種方法。一般利用計數(shù)板(血球計數(shù)板)進行。既可用于分離(散)細胞培養(yǎng)接種前計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量,也可用于對培養(yǎng)物的細胞數(shù)量進行計數(shù)。不論計數(shù)的對象如何,均須制備分散的細胞懸液。 計數(shù)與計算過程
1)、在細胞計數(shù)板中央放置計數(shù)的蓋玻片。
2)、用玻璃虹吸管吸取細胞,讓虹吸管在蓋玻片上或下側的計數(shù)板凹蹧處流出懸液,至
蓋玻片被液體充滿為止。
3)、置顯微鏡下計數(shù)四角大方格內的細胞總數(shù)。對于壓線的細胞只計數(shù)在上線和左線者,
對于細胞團按單個細胞計數(shù)。
4)、按下式計數(shù)細胞懸液的密度:
細胞密度=(4 個大格細胞總數(shù)/4)×104個/ml×稀釋倍數(shù)
公式中乘以 104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為:
1.0mm(長)×1.0mm(寬)×0.1mm(高)=0.1mm3
而 1ml=1000mm3
細胞計數(shù)要點::: :
A. 進行細胞計數(shù)時,要求懸液中細胞數(shù)目不低于 104個/ml,如果細胞數(shù)目很少要進行離
心再懸浮于少量培養(yǎng)液中;顯微鏡下計數(shù)時,遇到 2 個以上細胞組成的細胞團,應按單個細
胞計算。如果細胞團>10%,說明細胞分散不充分; 或細胞數(shù)<200 個/10mm2或>500 個/10 mm2 時,說明稀釋不當,需重新制備細胞懸液。
B. 要求細胞懸液中的細胞分散良好,否則影響計數(shù)準確性。
C. 取樣計數(shù)前,應充分混勻細胞懸液,尤其是多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混
勻,以求計數(shù)準確;
D. 數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞,若細胞聚集成團時,只按照一個細胞計算。如果細
胞壓在格線上時,則只計上線,不計下線,只計左線,不計右線。
E. 操作時,注意蓋玻片下不能有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中,否則要重新計數(shù)。
初學者易犯的錯誤::: :
A. 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。
B. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。
C. 滴入懸液時的量太多,至使細胞懸液流入旁邊的槽中。
11. . . . 生產(chǎn)企業(yè)
12. . . . 參考文獻
[1] Meier C, Middelanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after perinatal
brain damage in rats Is reduced by human cord blood mononuclear cells[J]. Pediatric
Research, 2006,59(2):244-249.
[ 2] Boyle AJ, Schulman SP, Hare JM , et al. Stem cell therapy for cardiac
repair:ready for the next step[J]. Circulation, 2006, 114(4):339-352.
[3] 程范軍,鄒 萍,楊漢東,等.人臍血間充質干/ 祖細胞誘導為心肌樣細胞的實驗研究[J].
中華器官移植雜志,2003,24:220-222.
[4] Dennis JE, Charbord P. Origin and differentiation of human and murine stroma
[J]. Stem Cells,2002,20(3):205.
[5] Yu JC, Daniel TS, Ching PT, et al. Disparate mesenchyme-lineage tendencies
in mesenchymal stem cells from human bone marrow and Umbilical Cord Blood[J]. Stem
Cells, 2006,24(3) : 679-685.
[6] Compagnoli C, Roberts IAG, Kumar S, et al. Identification of mesenchymal
stem/progenitor cells in human first trimester fetal blood, liver and bone marrow
[J]. Blood, 2001,98:2396-2402.
[7] Miura M, Gronthos S, Zhao M, et al. SHED: stem cells from human exfoliated
deciduous teeth[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100:5807–5812.
[8] 遲作華, 張 洹, 何冬梅, 等. 臍血間充質干細胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 中國實用內
科雜志,2006, 26(5):372-375.
[9] 向 靜, 江德鵬, 王昌銘,等. 臍血單個核細胞體外培養(yǎng)和誘導后神經(jīng)干細胞標志物
mRNA 的表達[J]. 重慶醫(yī)科大學學報,2005 ,30 (3):352-355.
[10] 孫海梅,季鳳清,李榮平,等.不同培養(yǎng)條件下人臍血間充質干細胞的差異[J]. ***,
2006, 10( 45 ):51-53.
[11] 朱美玲,伍新堯,陳汝光,等.不同分離方法分離臍血造血細胞效率的比較[J]. 中
國輸血雜志,2002 , 15 (3):179-780.
[12] 鄭德先,吳克復,褚建新.現(xiàn)代實驗血液學研究方法與技術.北京醫(yī)科大學中國協(xié)和
醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1999.
[13] 鄂征.組織培養(yǎng).北京出版社,1995.
[14] 朱立平,陳學清.免疫學常用實驗方法.人民軍醫(yī)出版社,2000.