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速來(lái)看看CCK-8試劑盒的操作步驟
更新時(shí)間:2022-09-16 點(diǎn)擊次數(shù):1371次
  CCK-8試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA).已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。先將生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過(guò)的HRP。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關(guān)系。
  CCK-8試劑盒的操作步驟:
  1、配制瓊脂糖EB凝膠,電泳以分離DNA片段。任何類型或等級(jí)的瓊脂糖都可以使用。
  我們強(qiáng)烈的推薦使用新鮮的TAE/TBE電泳緩沖液。不要重復(fù)使用電泳緩沖液,舊的電泳緩沖液PH會(huì)增加而降低DNA的回收產(chǎn)量;
  2、電泳足夠時(shí)間后,在紫外燈下小心地把所需的DNA的片段切下來(lái)。并盡量去除多余的凝膠。
  注意:DNA在紫外燈下的曝光的時(shí)間不要超過(guò)30秒,同時(shí)在紫外燈下操作的時(shí)候一定要戴保護(hù)眼鏡。
  3、稱取空離心管的重量,切下帶目的片段的凝膠裝在1.5ml離心管中并稱其重量,求出凝膠塊的重量,近似地確定其體積。一般情況下,凝膠的密度為1g/ml,于是凝膠的體積與重量的關(guān)系可按下面換算:凝膠薄片的重量為0.2g則其體積為0.2ml;加入等倍凝膠體積的BindingBuffer,把混合物置于55℃~65℃水浴中溫浴7min至凝膠*融化,其間每隔2-3分鐘混勻一次;
  重要提醒:在凝膠*溶解之后,注意凝膠-BindingBuffer混合物的pH值。如果其pH值大于8的話,DNA的產(chǎn)量將大大減少。觀察混合物的顏色,如果是橙色或紅色,則要加入5μl濃度為5M,pH為5.2的醋酸鈉,以調(diào)低其pH值。經(jīng)過(guò)這一調(diào)節(jié),該混合物的顏色將恢復(fù)為正常的淺黃色。一般情況下,使用新鮮的電泳緩沖液,凝膠-Bindingbuffer混合物的PH值的不會(huì)升高;
  4、轉(zhuǎn)移700μl的DNA-瓊脂糖溶液到一個(gè)HiBindTMDNA柱子,并把柱子裝在一個(gè)干凈的2ml收集管內(nèi),室溫下,10,000×g離心1min,棄去液體。
  一個(gè)HiBindDNA柱子最多可容納700μl的溶液,如果DNA-瓊脂糖混合物的體積大于700μl,可先轉(zhuǎn)移700μl溶液至柱子,離心完后,將余下的溶液繼續(xù)加上柱子上。但是每一個(gè)HiBindTM柱子最多可以結(jié)合25~30μgDNA。如果預(yù)期產(chǎn)量較大,則把樣品分別加到合適數(shù)目的柱中。
  5、將柱子重新套回收集管中,加300μlBindingBuffer至HiBindDNA柱子中;室溫下,10,000×g離心1分鐘,去棄濾出液;這一步相當(dāng)關(guān)鍵,不要忽略此步。
  6、將柱子重新套回收集管中,加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室溫下,10,000×g離心1分鐘,去棄濾出液;注:SPWWashbuffer在使用前必須按瓶子標(biāo)鑒要求用無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋。
  7、將柱子重新套回收集管中,重復(fù)加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室溫下,10,000×g離心1分鐘,去棄濾出液;
  8、棄去液體,將空柱子重新套回收集管中,10,000×g離心1min以甩干柱基質(zhì)殘余的液體。
  這步可以去除柱子基質(zhì)上殘余的乙醇,不要省略此步―――對(duì)得到好的DNA產(chǎn)量是十分重要的。
  9、把柱子裝在一個(gè)干凈的1.5ml離心管上,加入30~50μl洗脫液或滅菌水上柱子膜上,10,000×g離心1分鐘,離心管中的溶液就是純化的DNA產(chǎn)物,保存于-20度。

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