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 小鼠畸胎瘤細(xì)胞（P19）

細(xì)胞介紹

加拿大渥太華大學(xué)的Mc Burney 等在1982 年從雄性小鼠畸胎瘤中分離得到的 , 是一種能夠在體外培養(yǎng)的多能干細(xì)胞, P19 細(xì)胞團(tuán)經(jīng)RA 誘導(dǎo)可分化成神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和纖維母細(xì)胞; 而經(jīng)二甲基亞砜(DM SO ) 誘導(dǎo)則分化成心肌、骨骼肌和平滑肌細(xì)胞;在P19細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過程中，神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)模式基本模擬了正常小鼠神經(jīng)發(fā)育過程, 因此, P19 目前被用作一個(gè)研究神經(jīng)發(fā)育的體外模型。P19 細(xì)胞作為研究神經(jīng)分化機(jī)制的模型, 顯著區(qū)別于其他細(xì)胞系的四大特點(diǎn)是: ①它具有正常小鼠的二倍體核型, 細(xì)胞分裂快, 可在體外迅速大量擴(kuò)增, 多次傳代也不喪失其分化能力。②P19 細(xì)胞具有多種分化潛力, 不同誘導(dǎo)條件下可定向分化成不同類型的細(xì)胞, 種植到孕鼠囊胚中能分化成多種類型細(xì)胞。③根據(jù)P19 細(xì)胞誘導(dǎo)分化分階段進(jìn)行的特點(diǎn), 能將神經(jīng)分化的早期機(jī)制與參與突起延伸的機(jī)制分開研究。④該細(xì)胞易于轉(zhuǎn)染, 且轉(zhuǎn)染后仍能正常分化, 適于進(jìn)行細(xì)胞基因研究。通過轉(zhuǎn)染正常或突變的目的基因, 增強(qiáng)或抑制它們的表達(dá)水平可用于研究這些基因在神經(jīng)分化中的作用。另外, 利用反義RNA 阻斷內(nèi)源蛋白的表達(dá), 可用來觀察這些蛋白在神經(jīng)分化中的作用。

(references:1.張金平等. 全反式維甲酸體外誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌方向分化.[J]中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志.2012.1， 2.梅宇欽等. 建立經(jīng)優(yōu)化的促P19鼠胚胎癌細(xì)胞神經(jīng)分化模型.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）2012.04)

細(xì)胞特性

1） 來源：胚胎；畸胎癌

2） 形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

3） 含量：>1x10⁶

4） 污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性

5） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

運(yùn)輸和保存：可選擇干冰運(yùn)輸及發(fā)送復(fù)蘇存活細(xì)胞方式：（1）干冰運(yùn)輸，收到后立即轉(zhuǎn)入液氮或者-80度冰箱凍存或直接復(fù)蘇；（2）存活細(xì)胞，收到后應(yīng)繼續(xù)生長(zhǎng)，傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見細(xì)胞培養(yǎng)步驟。

收到細(xì)胞后請(qǐng)拍照，3天內(nèi)如果發(fā)現(xiàn)污染，請(qǐng)及時(shí)拍照與我們聯(lián)系。

細(xì)胞用途：僅供科研使用。

細(xì)胞接收后的處理：

1） 收到細(xì)胞后，請(qǐng)檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。

2） 在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，hao在低倍鏡（4或5X物鏡)下進(jìn)行，能準(zhǔn)確判斷細(xì)胞的傳代密度?？醇?xì)胞的形態(tài)請(qǐng)?jiān)?0X和20×物鏡下，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細(xì)胞需要售后時(shí)提供收到細(xì)胞時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3） 觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h。

4） 貼壁細(xì)胞：在運(yùn)輸過程中貼壁細(xì)胞會(huì)有脫落的現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞有脫落或者脫落后抱團(tuán)生長(zhǎng)，可將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到加有按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基的原培養(yǎng)瓶中（或新的培養(yǎng)瓶中）。

5） 懸浮細(xì)胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基）。

6）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。  收到細(xì)胞后第yi次傳代建議1：2傳代 。                      

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備MEMα（推薦iCell-0003）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，2.5%；小牛血清，7.5%；雙抗，1%。注：該細(xì)胞只單使用一種血清培養(yǎng)，不能保證細(xì)胞狀態(tài)。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細(xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

注：第yi次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

下面T25瓶為類；

      1，細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

      2，4min 1000rpm 離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x10⁶/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

      3，將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

2. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：