80年代后人們開始使用基因工程技術(shù)制備抗體,并進(jìn)而將抗體分子片斷與其它蛋白(或另一種抗體分子)融合得到多功能試劑,到目前為止,基因工程抗體在免疫測(cè)定上的應(yīng)用尚處于一個(gè)初級(jí)階段。且主要是將抗體與其它蛋白以融合蛋白形式表達(dá)而得到多功能試劑,如澳大利亞學(xué)者應(yīng)用基因工程技術(shù)制備了抗人紅細(xì)胞抗體與HIV-1gpN41的融合蛋白。這種重組蛋白,即基因工程雙功能試劑,在此基礎(chǔ)上,建立了快速,靈敏和特異的自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(AGEN). 3.1 HIV-Elisa抗原/抗體試劑 1998年,美國(guó)首先研制第四代試劑,對(duì)檢測(cè)HIV的同時(shí)檢測(cè)P24(核心)抗原,故稱HIV抗原/抗體試劑,國(guó)內(nèi)已有引進(jìn). 抗原組成:gp160gp36gp170和單克隆抗p24抗體包被. 3.1.2 P24抗原測(cè)定 采用夾心法Elisa,即將將純化的已知抗體包被,當(dāng)加入帶測(cè)血清后,若血清中含有P24與包被抗體形成抗原抗體復(fù)合物,再加入酶(HRP)標(biāo)記HIV抗體。在抗原上又結(jié)合了酶標(biāo)記的抗體,加底物 顯色后在酶標(biāo)儀上讀結(jié)果。 近來(lái)為提高檢測(cè)血清中P24抗原的敏感性,將血清中免疫復(fù)合物(ICD)解離后再進(jìn)行測(cè)定。發(fā)展了(ICD) P24抗原測(cè)定技術(shù)。 3.1.3抗HIV-Elisa試劑 目前對(duì)HIV的檢測(cè)原料有了較大改進(jìn),主要如下: (1)可用于檢測(cè)血清或血漿中HIV IgM亞特異性抗體和檢測(cè)HIV-1、2和多種亞型。 (2)標(biāo)記的抗原: a.含HIV-1B亞型gp41和P24的HIV-1重組融合蛋白。 b.可特異性檢測(cè)血清或血漿中HIV M群的抗體,絕大多數(shù)HIV-1.0群和HIV-2群的抗體。 c.gp36免疫調(diào)控區(qū)的HIV-2多肽可測(cè)定特異性的HIV-2抗體。 d.gp41的倆段HIV 1.0群多肽,可測(cè)特異性HIV 1.0 群的抗體 和HIV 1M群的抗體。 從以上抗原設(shè)計(jì)保證HIV的來(lái)自不同亞型/或區(qū)域的抗原亞型抗體的檢測(cè)。減少了變異株的漏檢。 HIV-1.0.2對(duì)759份各類臨床樣品包括401份HIV-1感染不同階段病人樣品,204分HIV-2感染不同階段病人樣品,和154份與HIV無(wú)關(guān)的其他疾病患者的樣品的檢測(cè)結(jié)果。 特異性:99.93% 靈敏度:100% 對(duì)歐洲血液中心的8842份常規(guī)鮮血者樣品用HIV-1.0.2進(jìn)行評(píng)價(jià)篩選,并經(jīng)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果。 3.1.4 HIV 確認(rèn)試劑—免疫印記(WB或RIBA)試劑 判斷標(biāo)準(zhǔn) 我國(guó) HIV 抗體陽(yáng)性:至少二條膜帶(即gp160/gp120)或至少一條膜帶和p24(核心)帶同時(shí)出現(xiàn) 美國(guó) HIV-1陽(yáng)性(任何兩個(gè)中有二條帶(P24 gp41 gp120/gp160), HIV-2無(wú)陽(yáng)性 WHO : HIV -1 陽(yáng)性(不管有無(wú)核心帶或酶帶, 但有兩條膜帶) HIV-2陽(yáng)性(不管有無(wú)核心帶或酶帶,單有兩條膜帶即為陽(yáng)性)
基因工程酶及其融合蛋白 除了基因工程抗原、抗體外,與標(biāo)記免疫測(cè)定有關(guān)的另一中重要的基因工程試劑就是酶及其融合蛋白,以重組酶建立免疫測(cè)定方法較為成功的是CEDIATM均相酶免疫試驗(yàn)。 使用基因工程酶技術(shù)生產(chǎn)免疫測(cè)定標(biāo)記酶,是得到符合標(biāo)記要求的高純度酶的一條新途徑,但如以其他蛋白(抗原或抗體)融合的方法,不但避免了繁瑣且低效率的酶與蛋白的化學(xué)交聯(lián),而且無(wú)需得到純化的酶和抗原或抗體。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,將有越來(lái)越多的酶免疫測(cè)定方法建立在基因工程酶或其融合蛋白的基礎(chǔ)之上。 發(fā)展趨勢(shì)如下: 1)、由單一病原蛋白向多決定簇融合蛋白轉(zhuǎn)變,并盡可能包括病原體基因組功能區(qū)的所有的能引起肌體免疫應(yīng)答的決定簇。 2)、表達(dá)的抗原將盡可能少含有非特異性抗原 或共同抗原。 3)、為某一目的如病原體基因型確定而設(shè)計(jì)表達(dá)特定的多肽抗原片斷。 總之,將圍繞改善免疫測(cè)定的特異性和敏感性來(lái)制備基因工程片斷。 |