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DNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)
點(diǎn)擊次數(shù):755 更新時(shí)間:2015-05-08

  

 

 

                                     DNA轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)

                                       

DNAFect Transfection Reagent

 

目錄號(hào):YJ0860

保存:2-8℃

 

組分說(shuō)明

 

                                 Catalogno.               YJ0860          YJ0860A

                                    KitSize                 0.5 ml            1 ml

 

                        DNAFect Transfection Reagent         0.5 ml          1 ml

 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

DNAFect是一種的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,適用于多種細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系包括原代細(xì)胞都有較高的轉(zhuǎn)染效率,并且對(duì)細(xì)胞毒性極低。本轉(zhuǎn)染試劑可應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、共轉(zhuǎn)染、高通量DNA轉(zhuǎn)染,基因表達(dá)和基因功能研究。

 

注意事項(xiàng)

 

 1.轉(zhuǎn)染試劑使用前應(yīng)先震蕩搖勻。

 

 2.轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞密度有很大關(guān)系,不同實(shí)驗(yàn)間應(yīng)保持一個(gè)基本的傳代步驟,確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒(méi)有長(zhǎng)滿或處于靜止期。

 

    一般貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染的*細(xì)胞密度是80-90%,懸浮細(xì)胞的*細(xì)胞密度為3-5×10 5細(xì)胞/ml,用于轉(zhuǎn)染的*細(xì)胞密度

 

                                                                              

3. 轉(zhuǎn)應(yīng)染根據(jù)不同的時(shí)不要在培細(xì)養(yǎng)胞基中加入抗生素,否類型或用途而異。則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。  

 

 

操作步驟

 

     對(duì)于大部分的細(xì)胞系, DNA與DNAfect的比例在1:2至1:3時(shí)轉(zhuǎn)染效率較高。為了提高轉(zhuǎn)化效率、表達(dá)水平并且減少細(xì)胞毒性,實(shí)驗(yàn)應(yīng)在細(xì)胞密度較大時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以下操作以24孔板每孔細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染操作為例。

     1.   貼壁細(xì)胞:轉(zhuǎn)化前一天,在24孔板的每孔中加入500 μl無(wú)抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基,并于每孔中接種0.5-2×105 個(gè)細(xì)懸浮細(xì)胞:在胞,待細(xì)胞轉(zhuǎn)細(xì)染之前,在胞長(zhǎng)至80-90%24孔板的滿時(shí)進(jìn)每行孔中加入轉(zhuǎn)染。500μl無(wú)抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基,并于每孔中接種3-5×10 5個(gè)細(xì)胞。

 

     2.   轉(zhuǎn)染當(dāng)天,首先準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合物,對(duì)于每孔細(xì)胞按照以下用量配制:

          a. 取適量DNA,加入25 μl無(wú)血清培養(yǎng)基,并輕輕的混合均勻。

          b. 取適量DNAfect,加入25 μl無(wú)血清培養(yǎng)基,輕輕混勻,并于室溫孵育5分鐘。

 

          c. 孵育5分鐘之后,將稀釋的DNA和稀釋的DNAfect混合(使DNA以及DNAfectin的終總體積為50 μl),輕輕混合均勻,并在室溫下孵育20分鐘(溶液可能會(huì)出現(xiàn)絮狀,但不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率)

 

              

    注意:該混合物在室溫下可以穩(wěn)定保存6小時(shí)。

     3.   將步驟1中24孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換成450 μl無(wú)血清培養(yǎng)基,然后將步驟2中50 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24細(xì)胞孔板內(nèi),輕輕前后推動(dòng)24孔板以混勻。

 

     4.   將細(xì)胞置于含5%CO2,37℃條件下培養(yǎng)4-6小時(shí)后,更換成500 μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

     5.   18-48小時(shí)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染基因表達(dá)的檢測(cè)。

 

     6.   對(duì)于穩(wěn)定的細(xì)胞系:在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,細(xì)胞按照1:10的比例傳代,第二天可加入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

 

        注:(1) 該說(shuō)明為一個(gè)24孔的用量,若同時(shí)轉(zhuǎn)幾個(gè)孔,配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物的量需加倍;若轉(zhuǎn)染其他類型孔板,DNA和DNAfect用量見(jiàn)附表,

 

              該附表用量以293T細(xì)胞為轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)用量。

 

             (2) 轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后也可以不更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基,但由于DNAfect具有一定的細(xì)胞毒性,作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能使某些細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象,建議更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

 

            (3) 優(yōu)化條件:想要得到更高的轉(zhuǎn)染效率,應(yīng)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件:培養(yǎng)物、DNA濃度、細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞與DNA復(fù)合物的孵育時(shí)間等條件都應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化。

 

           

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