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磷脂酶 A2(phospholipase A2,PLA2)試劑盒說(shuō)明書(shū)微量法
點(diǎn)擊次數(shù):92 更新時(shí)間:2024-10-11

磷脂酶 A2(phospholipase A2,PLA2)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

磷脂酶A2(EC3.1.1.4)是磷脂sn-2位脂?;饷?,廣泛存在于動(dòng)植物組織、細(xì)菌、細(xì)胞核分泌物中,參與脂肪消化,精子成熟、細(xì)胞信號(hào)傳遞、脂質(zhì)過(guò)氧化修復(fù)、宿主反應(yīng)等生理過(guò)程,在控制體內(nèi)磷脂類(lèi)物質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝、參與疾病的病理進(jìn)程等方面發(fā)揮著及其重要的作用。

測(cè)定原理

磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿(HEPC)產(chǎn)生游離巰基,與DTNB反應(yīng)生成黃色物質(zhì),在412nm處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、超速冷凍離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板。

試劑組成和配制

提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。

試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。

試劑二:液體 20mL×1 瓶,4℃保存。

試劑三:液體×5 瓶,-20℃避光保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加入 1.8mL 試劑二充分混勻。(3天使用完)

樣品處理

1. 組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于 4℃,10000g 離心5min,取全部上清于4℃、100000g離心30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。

2. 細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后于4℃,10000g 離心5min,取全部上清于4℃、100000g 離心 30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。

3. 血清:直接測(cè)定。

測(cè)定操作


對(duì)照管

測(cè)定管

樣品(μL)

20

20

試劑二(μL)

180


試劑三(μL)


180

充分混勻,37℃反應(yīng) 10min,于微量石英比色皿/96 孔板,蒸餾水調(diào)零,測(cè)定 412nm 處吸光值,記為 A 對(duì)照管和 A 測(cè)定管,△A=A 測(cè)定管- A 對(duì)照管

 

計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1.按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性(nmol/min/mg prot= ε×d×V 反總÷(V ×Cpr÷T

= 73.53×△A÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義:每克組織每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性(nmol/min/g= ε×d×V 反總÷(W×V ÷V 樣總)÷T

= 73.53×△A÷W

3. 細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義:每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力

單位。

PLA2 活性(nmol/min/104cell= ε×d×V 反總÷(V ×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總)÷T= 73.53×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4 按照液體體積計(jì)算

酶活性定義:每毫升血清每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性(nmol/min/mL= ε×d×V 反總÷V ÷T= 73.53×△A

εTNB 消光系數(shù),13600L/mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V 反總:反應(yīng)總體積,1mL;V 樣:反應(yīng)體系中加入樣本體積,0.1mL;W:樣本質(zhì)量,g;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,10min

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1.按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性(nmol/min/mg prot= ε×d×V 反總÷(V ×Cpr÷T

=147.06×△A÷Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義:每克組織每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性(nmol/min/g= ε×d×V 反總÷(W×V ÷V 樣總)÷T

= 147.06×△A÷W

3. 細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義:每104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2活性(nmol/min/104cell= ε×d×V 反總÷(V×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總)÷T=147.06×△A÷細(xì)胞數(shù)量

4 按照液體體積計(jì)算

酶活性定義:每毫升血清每分鐘水解HEPC產(chǎn)生1nmol游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

 

PLA2 活性(nmol/min/mL= ε×d×V 反總÷V ÷T

= 147.06×△A

εTNB 消光系數(shù),13600L/mol/cmd:比色皿光徑,0.5cm;V 反總:反應(yīng)總體積,1mL;V 樣:反應(yīng)體系中加入樣本體積,0.1mL;W:樣本質(zhì)量,g;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,10min

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