蔗糖合成酶(分解方向;SS-Ⅰ)試劑盒說明書
微量法 100 管/48 樣
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義
蔗糖是源(葉片等)光合產(chǎn)物向“庫(kù)"器官運(yùn)輸?shù)闹饕螒B(tài)。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13)是雙向反應(yīng)酶,既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解,是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。研究其分解方向 SS-Ⅰ的活性對(duì)于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意義。
測(cè)定原理
SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游離果糖和UDPG,采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖的含量來反映酶活性的高低。
需自備的儀器和用品
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰
試劑的組成和配制
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存; 試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存; 試劑二: 液體 5mL×1 瓶,4℃保存;
試劑三:粉劑×2 支,-20℃保存;臨用前每支加入 1.2mL 試劑二充分溶解待用,現(xiàn)配現(xiàn)用; 試劑四:液體 6mL×1 瓶,4℃保存。
樣品測(cè)定的準(zhǔn)備:
按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL
提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。
測(cè)定步驟
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 540nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測(cè)定,(在 EP 管中依次加入下列試劑):
試劑名稱(μL)測(cè)定管對(duì)照管
樣本1010
試劑三40
試劑一40
混勻,30℃準(zhǔn)確水浴 30min 后,95℃水浴 10min 95℃水浴 5min 左右,冷卻至室溫
混勻,取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中,540nm 下測(cè)定各管吸光值。ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需要設(shè)一個(gè)對(duì)照管。
SS-Ⅰ活性計(jì)算
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0012x - 0.0492;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y 為ΔA。
2、按照蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0012×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=138.9×(ΔA+0.0492) ÷Cpr
3、按照樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/g 鮮重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0012×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T
=138.9×(ΔA+0.0492) ÷W
V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.05mL; V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0006x - 0.0492;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL),y 為ΔA。
2、按照蛋白濃度計(jì)算
單位定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)= (ΔA+0.0492) ÷0.0006×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=277.8×(ΔA+0.0492) ÷Cpr
3、按照樣本鮮重計(jì)算
單位定義:每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個(gè)酶活力單位。
SS-Ⅰ活性(μg /min/g 鮮重) =(ΔA+0.0492) ÷0.0006×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T
=277.8×(ΔA+0.0492) ÷W
V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.05mL; V 樣:加入樣本體積,0.01 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g。
從2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及論文潤(rùn)色服務(wù),協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤(rùn)色十余年,是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!
如果您受時(shí)間、試驗(yàn)條件等限制而無法完成您的課題研究,歡迎您與我們聯(lián)系。
實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù):