本試劑盒只能用于科學(xué)研究,不得用于醫(yī)學(xué)診斷
人(Human)抗角蛋白絲聚集素/絲集蛋白抗體(AFA)
ELISA檢測(cè)試劑盒
使用說(shuō)明書(shū)
檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被抗絲集蛋白抗原包被微孔中,依次加入標(biāo)本、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗原,經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值),與CUTOFF值相比較,從而判定標(biāo)本中抗角蛋白絲聚集素/絲集蛋白抗體(AFA)的存在與否。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5. 保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標(biāo)儀(450nm)
2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項(xiàng)
1. 試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶,這屬于正?,F(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再使用。
2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。
3. 預(yù)處理后的樣本無(wú)需稀釋,直接取50μL加樣即可。
4. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標(biāo)板 | 12孔×8條 | 12孔×4條 | 無(wú) |
陰性對(duì)照 | 0.5mL | 0.5mL | 無(wú) |
陽(yáng)性對(duì)照 | 0.5mL | 0.5mL | 無(wú) |
樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
檢測(cè)抗原-HRP | 10mL | 5mL | 無(wú) |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋 |
底物A | 6mL | 3mL | 無(wú) |
底物B | 6mL | 3mL | 無(wú) |
終止液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無(wú) |
說(shuō)明書(shū) | 1份 | 1份 | 無(wú) |
自封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | 無(wú) |
試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
1. 手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。
2. 自動(dòng)洗板機(jī):每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔,陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各50μL;
3. 待測(cè)樣本孔加待測(cè)樣本10μl,樣本稀釋液40μL;
4. 隨后陰、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗原100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。
6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
1. 試驗(yàn)有效性:陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00;
陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15。
2. 臨界值(Cut off)計(jì)算:臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15
3. 陰性判斷:樣品OD值<臨界值(Cut off),樣品為陰性
4. 陽(yáng)性判斷:樣品OD值>臨界值(Cut off),樣品為陽(yáng)性
試劑盒性能
1. 準(zhǔn)確性:陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00;陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15,說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果有效。
2. 特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
3. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
4. 貯藏:2-8℃,避光防潮保存。
5. 有效期:6個(gè)月
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