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2×GoldStar Best MasterMix(無染料)操作說明書
點擊次數(shù):947 更新時間:2022-06-13

2×GoldStar Best MasterMix(無染料)說明書

 

 

 

號:K0656

 

保存條件:-20℃長期保存,如需頻繁使用,可存放于2-8℃,盡量避免反復(fù)凍融。

 

組分說明

 

               Cat. No.                         K0656      K0656B

               Kit Size                         1 ml       5×1 ml

               2×GoldStar Best MasterMix        1 ml       5×1 ml

               RNase-Free Water                 1 ml         5 ml

           注意:2×GoldStar Best MasterMix含有GoldStar  Best DNAPolymerase,

 

                2×GoldStar Best PCR  Buffer, 3 mM MgCl2400 µM  dNTPs。

 

產(chǎn)品簡介

 

  本品為由GoldStar Best  DNA Polymerase、PCR Buffer、MgdNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增強劑組成的預(yù)混體系,濃度為 2×,具有操作簡便快速、靈敏度高、特異性2+強、穩(wěn)定性好的優(yōu)點,可最大限度地減少人為誤差和污染。該產(chǎn)品所含的      GoldStarBest DNA Polymerase是經(jīng)過特殊處理的熱啟動高保真聚合酶。該聚合酶具有5-3DNA聚合酶活性,5-3′核酸外切酶活性和  3-5′核酸外切酶活性,在普通PCR條件下,與GoldStar Taq DNA Polymerase相比,具有擴增效率高、錯配率低的優(yōu)良性能。化學(xué)修飾使該酶在常溫下沒有聚合酶活性,有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結(jié)合或引物二聚體而產(chǎn)生的非特異性擴增,酶的激活須在 95℃下孵育10分鐘,該條件可以整合入已有的PCR熱循環(huán)程序。優(yōu)化的緩沖體系使酶的作用發(fā)揮最大功效,實現(xiàn)對目的片段的高保真、高特異性、高擴增效率、高靈敏度擴增。本品不含染料,PCR序結(jié)束后可根據(jù)需要加入適量上樣緩沖液后進行電泳操作。擴增得到的 PCR產(chǎn)物3′端附有一個A"堿基,因此可直接用于 T/A克隆。適用于常規(guī)的 PCR反應(yīng)和對高保真性有要求的基因克隆等實驗。

 

質(zhì)量控制

 

  經(jīng)檢驗無外源核酸酶活性; PCR方法檢測無宿主殘余DNA;能有效地擴增多種基

因組中的單拷貝基因;2-8℃存放三個月,活性無明顯改變。

 

                本產(chǎn)品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途


 

    使用方法

 

    以下舉例為常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,實際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的

    片段大小不同進行相應(yīng)的改進和優(yōu)化。

 

    1. PCR反應(yīng)體系

 

              試劑                             50 μl反應(yīng)體系           終濃度

              2×GoldStar Best MasterMix          25 μl             1×

              Forward Primer,10 µM                2 μl           0.4 μM

              Reverse Primer10 µM                2 μl           0.4 μM

              Template DNA                       <1 μg        <1 μg/reaction

              RNase-Free Water                 up to 50 μl

 

       注意:引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴增效率不高的情況下,可提高引物的濃度;發(fā)生非特異性反應(yīng)時,可降低引物濃度,由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

 

    2. PCR反應(yīng)條件

 

步驟                 溫度              時間

預(yù)變性                95℃            10 min

變性                 94℃             30 s

退火               55-65℃            30 s     30-40個循環(huán)

延伸                 72℃             60 s

終延伸               72℃             5 min

 

       注意:1)一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm5℃,無法得到理想的擴增效率時,適當降低退火溫度;發(fā)生非特異性反應(yīng)時,提高退火溫度,由此優(yōu)化反應(yīng)條件。

       2)延伸時間應(yīng)根據(jù)所擴增片段大小設(shè)定,本產(chǎn)品中所包含的GoldStar Best DNA Polymerase的擴增效率為1 kb/min。

 

       3)可根據(jù)擴增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少,擴增量不足;如果循環(huán)次數(shù)太多,錯配機率會增加,非特異性背景嚴重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

       4)本產(chǎn)品須在預(yù)變性95℃,10 min條件下實現(xiàn)酶的活化。

 

    3.結(jié)果檢測:本產(chǎn)品不含染料,反應(yīng)結(jié)束后,取5 µl反應(yīng)產(chǎn)物加入適量上樣緩沖液后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

 

 

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