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恩諾沙星殘留檢測(組織/雞蛋/血清/蜂蜜)
點擊次數(shù):2333 更新時間:2021-08-04

                     

恩諾沙星

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

    試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物恩諾沙星藥物和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗恩諾沙星藥物抗體,加入酶標記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留恩諾沙星藥物的含量成負相關(guān),與標準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物恩諾沙星藥物的含量。

二、試劑盒特性

試劑盒靈敏度:      1ppb

孵育溫度:          25

孵育時間:          30min15min

樣本檢測下限

恩諾沙星檢測下限      ····················  1ppb

交叉反應(yīng)率

恩諾沙星   ··························    100%

樣本回收率

組織 /雞蛋 ···································  80±15%

    ······································  80±15%

    ······································  75±15%

三、試劑盒組成

1

微量測試孔

每條8孔,一板12

2

標準液×6

1ml/瓶)

0ppb

1ppb

3ppb

9ppb

27ppb

81ppb

3

酶標記物

7ml

紅色帽

4

抗體工作液

7ml

藍色帽

5

底物A

7ml

白色帽

6

底物B

7ml

黑色帽

7

終止液

7ml

黃色帽

8

20X濃縮洗滌液

40ml

白色帽

9

2X濃縮復(fù)溶液

50ml

透明帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器微孔酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平(感量0.01g)

微量移液器:單道 20200ul、單道1001000ul、多道 250 ul

      劑:濃鹽酸、二氯甲烷、正己烷、乙腈、肝素鈉、Na2HPO4·12H2ONaH2PO4·2H2O

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

處理任何樣本時,都必須注意:

(a) 本試劑盒所檢測的組織樣本包括:動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。

(b) 實驗中必須使用一次性吸頭,在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

(c) 實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,必要時可對實驗器具進行清潔,以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理需配制:

配液1  0.1M HCL溶液:  

        860µl濃鹽酸加去離子水100ml溶解。

配液2  乙腈-二氯甲烷混合溶液:

         V乙腈V二氯甲烷  =  1 : 4

配液3  pH7.2  0.02M PB緩沖液:      

   5.16g Na2HPO4·12H2O + 0.87g NaH2PO4·2H2O  

    加去離子水1L溶解。

配液4  乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl混合溶液

100ml乙腈-二氯甲烷(V乙腈V二氯甲烷  = 4 :1) 混合溶液中加入5ml 0.1M HCl溶液。

配液5  用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1:1稀釋  

1份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水)用于樣本復(fù)溶。

(a)組織樣本(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)雞蛋

1、稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中;

2、加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml,振蕩5min,4000r/min以上,15℃離心10min;

3、取4ml有機相至干燥容器中,56℃氮氣吹干/旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干;

4、用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,加入正己烷1ml混合30s,4000r/min以上,15℃離心5min;

5、去除上層取下層50µl液體用于分析。

     樣本稀釋倍數(shù):1

b)血清樣本的處理

1、用加有肝素鈉(20-30單位/ml血)的離心管采集雞血樣本(建議采血注射器也用肝素鈉潤洗),血樣本室溫靜置1h,待析出血漿后4000r/min以上,15℃離心10min,取出血漿1ml;

2、加入乙腈(無水)4ml上下充分混合5min,4000r/min以上,15℃離心10min;

3、移上清至另一離心管中,加入2ml 0.02M PB緩沖液,混勻;

4、加入二氯甲烷5ml,充分混勻5min,4000r/min,15℃離心10min,去上層,取下層有機相到干燥瓶中(清亮無雜質(zhì)),50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干/氮氣吹干;

5、1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,加入正己烷1ml混合30s,4000r/min以上,15℃離心5min;

6、輕吸掉上層和中間白色雜質(zhì),取下層相100µl加入100µl稀釋后的復(fù)溶液,混合30s;

7、50µl用于分析。

       樣本稀釋倍數(shù):2

c)蜂蜜樣本處理方法:

1、 2.0±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中;加入8ml乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl混合溶液, 充分振蕩3min,15℃ 4000r/min以上離心10min;

2、 2ml上清液于56℃氮氣或空氣流吹干;

3、 加入1ml的樣本復(fù)溶液,充分震蕩1min;

4、 50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  2倍

六、 酶標免疫分析程序:

測定前應(yīng)須知:

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(20-25℃)。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、 ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟:

5、 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出,置室溫(20-25℃)平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

6、 按需要取出微孔條及板架,將不用的微孔板重新密封,保存于2-8℃,不要冷凍

7、 配液:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液。

8、 編號:將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標準品均需做2孔平行,并記錄標準孔的樣本孔所在的位置。

9、 加標準品/樣本50µl /孔,然后加酶標記物50μl/孔,再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板,25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

10、 用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次,每次浸泡15-30秒,拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

11、 顯色:每孔加入底物A液50µl再加入底物B液50µl,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境避光顯色15min

12、 測定:每孔加入終止液50µl,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測定吸光度值(OD值)。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含恩諾沙星藥物量成負相關(guān)。

1、粗略判定:

    用樣本的平均吸光度值與標準品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.238, 樣本2的吸光度值為0.946,標準液吸光度值分別是:0ppb為1.845; 1ppb為1.542;3ppb為1.130; 9ppb為0.635;27ppb為0.326; 81ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是27ppb - 81ppb;樣本2的濃度范圍是3ppb - 9ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中恩諾沙星藥物的實際濃度。

2、定量分析

1)百分吸光率的計算,標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值,再乘以100%,即

百分吸光率(%)=

B

×100%

B0

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

2)標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標,以恩諾沙星標準品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標,繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中恩諾沙星藥物實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,更便于大量樣本的準確、快速分析。(歡迎來電索取)

八、 注意事項

1、 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫(20-25℃)會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標準曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封;標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時,表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、 儲藏條件:試劑盒于2-8保存,不要冷凍。

2、  質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示:酶標板真空包裝袋若有漏氣,酶標板仍然正常有效,不影響實驗結(jié)果,請放心使用。


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