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一步法快速WB(HRP)試劑盒(兔)常見問題解答
點(diǎn)擊次數(shù):2448 更新時(shí)間:2021-04-01

一步法快速WBHRP)試劑盒(兔)說明書

 

One Step Western Kit HRP (Rabbit)

目錄號(hào):K2029

保存條件:2-8℃保存,避免冷凍。

 

 組分說明

 Cat. No.             K2029                K2029A         K2029B

Kit Size               10                            2             50

封閉液        125 ml                     3 0ml        500 ml

抗體反應(yīng)液     HRP(兔)1 ml      2 0 0μl     5×1 ml

抗體稀釋液     125 ml                       3 0m l       500 ml

漂洗液(10×) 125 ml                      3 0 m l        500 ml

 

 本產(chǎn)品僅供科研使用,請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途產(chǎn)品簡介

 

  一步法快速WB試劑盒(兔)是上海研謹(jǐn)生物近期推出的Western Blot檢測(cè)試劑盒,能夠在1小時(shí)左右得到高質(zhì)量的Western Blot結(jié)果,且操作簡便、檢測(cè)靈敏度高、背景低、不需再加入二抗、系統(tǒng)穩(wěn)定性強(qiáng)。常規(guī)的Western Blot間接法檢測(cè)過程(封閉、一抗結(jié)合和二抗結(jié)合)需要較長的時(shí)間,實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜且需要多步條件優(yōu)化。膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到載體膜上后,使用試劑盒中的封閉液孵育5 min,再用抗體反應(yīng)液處理后的一抗孵育載體膜,經(jīng)洗滌三次(每次5 min)后,即可進(jìn)行發(fā)光或顯色檢測(cè)。本試劑盒針對(duì)目的蛋白一抗為兔來源的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)使用。

 

注意事項(xiàng)

 

1. 客戶需自己準(zhǔn)備兔來源的一抗。

2. 使用封閉液、抗體稀釋液(兔)、漂洗液之前請(qǐng)充分混勻。

3. 漂洗液如在2-8℃保存時(shí)出現(xiàn)沉淀,請(qǐng)恢復(fù)到室溫,把沉淀溶解后正常使用,1×漂

洗液可在室溫保存一個(gè)月。

4. 建議轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅等試劑染色,并把膜上多余部分剪去以增加試劑的使用效

率。

5. 一抗和抗體反應(yīng)液HRP(兔)需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定最*+佳的稀釋用量。

6. 抗體反應(yīng)液HRP(兔)、抗體稀釋液和抗體用量可根據(jù)膜的大小按比例放大或減少。

7. 加入一抗的抗體稀釋液可以回收重復(fù)使用一次。特異性及親和力低的抗體不建議重

復(fù)使用?;厥蘸罂贵w如在1-2天內(nèi)使用放置在2-8℃,長期保存請(qǐng)?jiān)?/font>-20℃凍存,避

免多次反復(fù)凍融。

8. 如果存在較高背景的情況,請(qǐng)調(diào)整抗體的用量,并增加洗膜次數(shù)。

9. 試劑盒內(nèi)所有試劑請(qǐng)于2-8℃保存,避免凍融。

 

操作步驟

 

本產(chǎn)品適用于轉(zhuǎn)膜完成后的封閉及抗體孵育步驟,以5 cm×8 cm 膜為例:

1.漂洗液準(zhǔn)備:取10 ml 10×漂洗液用蒸餾水稀釋至100 ml待用。每次洗膜用8-10 ml。

2.轉(zhuǎn)膜完成后,將膜浸沒到10 ml封閉液中,室溫封閉5分鐘。

3.倒掉封閉液,加入8-10 ml 1×漂洗液,于搖床上用較大速度漂洗1分鐘。

4.洗膜的同時(shí)可準(zhǔn)備抗體孵育液:取抗體反應(yīng)液HRP(兔)100 μlEP管中,加入兔

源一抗3-10 μg,槍頭吸打至充分混勻,室溫孵育5分鐘。

5.將混勻的抗體與反應(yīng)液HRP(兔)混合液加入到10 ml 抗體稀釋液中,充分混勻。

 

    注意:1)一抗的用量也可根據(jù)抗體的稀釋度來進(jìn)行調(diào)整。以抗體的最終稀釋度1:1000為例,取100 µl抗體反應(yīng)液HRP(兔)到EP管中,加入10 µl一抗,加入到10 ml 抗體稀釋液中,充分混勻,室溫孵育5分鐘。

 

   2)如果膜面積較小,可按比例減少抗體、反應(yīng)液及稀釋液的用量。

6.步驟3中,洗膜完成后,倒掉漂洗液,將混合一抗、反應(yīng)液及稀釋液的抗體孵育液

加到膜上(確保孵育液*浸沒膜表面),在搖床上以60rpm左右的速度室溫孵育40分鐘。

7.棄去(回收)抗體稀釋液,用1×漂洗液漂洗3-5次,每次3分鐘。

8.進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。建議采用ECL試劑盒(K0049)進(jìn)行檢測(cè)。

 

  常見問題解答                

    

 信號(hào)太弱或者看不到條帶

原因

a蛋白上樣量太少

b蛋白轉(zhuǎn)膜效率太低

c一抗親和力較低

解決方案:

a進(jìn)行SDS-PAGE電泳時(shí)加大上樣量。

b優(yōu)化轉(zhuǎn)膜時(shí)間或者電流,確保轉(zhuǎn)膜時(shí)膜與膠之間沒有氣泡。

c增加膜在溶液(含有mixture 1WB-2)中的孵育時(shí)間。

 增加抗體濃度可以增加信號(hào)。

d 對(duì)于低親和力抗體來說,減少洗膜時(shí)間可以增加信號(hào)。     

由每次10min,減少到每次5min可以增加信號(hào)。                 

                                   

 背景偏高

原因

a一抗使用過量

b一抗有非特異性結(jié)合或者與封閉試劑有交叉反應(yīng)

c洗膜時(shí)間太短

d曝光顯影時(shí)間過長

e容器或者試劑被污染

解決方案:

A減少一抗的使用量,相應(yīng)的減少WB-1用量。

B使用pretreat A-bM01052)。 客戶還可以使用Quick Block Optimization kit 來找到最*+佳的封閉試劑。

C增加洗滌的步驟可以進(jìn)一步的降低背景。

D減少曝光時(shí)間。如果信號(hào)和背景都高,可以等待一段時(shí)間,等背景信號(hào)減弱后,再進(jìn)行曝  光。

e每次洗滌的時(shí)候使用清潔的容器。帶手套,使用清潔的鑷子處理膜。

 

   

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

 

WB代做

HE染色

免疫熒光染色

蛋白相互作用分析

ELISA免費(fèi)代檢測(cè)

免疫組化

熒光定量PCR

番紅O固綠染色

流式細(xì)胞檢測(cè)

激光共聚焦

透射電鏡服務(wù)

DNA甲基化實(shí)驗(yàn)

免疫共沉淀(Co-IP

DNA甲基化

掃描電鏡實(shí)驗(yàn)

microRNA 測(cè)序

半定量RT-PCR

分子克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建服務(wù)

原位雜交(FIsh

石蠟/冰凍切片

RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP

CCK8檢測(cè)

蛋白雙向(2-D)電泳

蛋白雙向2D-WB

ATP/ADP檢測(cè)

Taqman探針

細(xì)胞劃痕

基因組DNA提取

 

    

                   

    

        

 

 

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