氯霉素快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條 上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氯霉素將和微
孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素抗體，加入 酶標記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其 所含殘留物氯霉素的含量成負相關(guān)，與標準曲線比 較即可得出相應(yīng)殘留物氯霉素的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 0.05ppb
u 孵育溫度： 25℃
u 孵育時間： 30min～30min～15min
- 樣本檢測下限
蛋類、牛奶（方法一）····························· 0.1 ppb 尿液、血清、腸衣、飼料、奶粉··················· 0.05ppb 組織、肝臟、蜂蜜、牛奶（方法二）············· 0.025ppb
- 交叉反應(yīng)率
氯霉素· ······································· 100%
甲砜霉素 ······································ < 0.1%
氟甲砜霉素 ······································ < 0.1%
- 樣本回收率
組織、肝臟 ································ | 85%±20% | ||
蜂蜜、腸衣 ································ | 83%±25% | ||
牛奶、飼料 ································ | 75%±23% | ||
尿液、血清 ································ | 70%±18% | ||
三、試劑盒組成 |
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1 | 微量測試孔 | 每條 8 孔，一板 12 條 | |
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| 標準液×6 瓶 | 0ppb | 0.05ppb |
2 | 0.15ppb | 0.45ppb | |
（1ml/瓶） | |||
| 1.35ppb | 4.05ppb | |
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3 | 酶標記物 | 12ml | 紅色帽 |
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4 | 抗體濃縮液 | 1ml | 藍色帽 |
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5 | 底物 A 液 | 7ml | 白色帽 |
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6 | 底物 B 液 | 7ml | 黑色帽 |
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7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
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8 | 20X 濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
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9 | 2X 濃縮復(fù)溶液 | 50ml | 透明帽 |
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四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、 刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮 吹儀、恒溫箱
微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：乙酸乙酯、乙腈、亞硝基鐵qing化鈉、葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)、硫酸鋅、醋酸鈉、正己烷、醋酸
五、樣本前處理步驟
- 樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試 劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈， 必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實 驗結(jié)果。
- 樣本前處理需配制：
配液 1 C 液（牛奶、奶粉樣本）：
10.7g 亞硝基鐵qing化鈉加去離子水 100ml 溶解。
配液 2 D 液（牛奶、奶粉樣本）：
28.8g 硫酸鋅加去離子水 100ml 溶解。
配液 3 pH4.8 100mM 醋酸鈉緩沖液（尿樣本）：稱 2.4g 醋酸鈉和 1.2ml 醋酸加去離子水500ml 溶解混合。
配液 4 乙腈-水溶液：乙腈：VH2O＝84：16
配液 5 樣本復(fù)溶液：將 2X 濃縮復(fù)溶液用去離子水按 1：1 稀釋。
| (1 份濃縮復(fù)溶掖+1 份去離子水，用于抗體 | 氮氣流下干燥；用 0.5ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥 | |
| 的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶)。 | 的殘留物，混合 30s； | |
u | 樣本處理： | 3、 取 50 µl 用于分析。 |
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（a）組織、肝臟樣本處理方法 | 樣本稀釋倍數(shù)： 0.5 倍 | ||
1、 稱取均質(zhì)后的樣本 3±0.05g 于 50ml 離心管中， | 檢測下限：0.025ppb | 定量下限：0.1 ppb | |
| 先加入 3ml 去離子水混勻后再加入 6ml 乙酸乙 | 注：我們推薦 0.1 ppb 為陽性樣本的 cut off 值。 | |
| 酯，振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上離心 10min； | （e）腸衣處理方法 |
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2、 取出 4ml 上層液體在 50-60℃氮氣流中吹干； | 1、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；注：干樣本需剪碎（長度 | ||
3、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 1ml | 不超 5mm）后再均質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂 | ||
| 樣本復(fù)溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 | 洗 20min 以上去除表面的鹽份，瀝干后再均質(zhì)； | |
| 5min；去除上層有機相； | 2、 稱 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中，加 | |
4、 取 50 µl 下層相用于分析。 | 入 10ml 乙酸乙酯，振蕩 2min，室溫 4000r/min | ||
| 樣本稀釋倍數(shù): 0.5 倍 | 以上離心 10min； |
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（b）血清血漿處理方法 | 3、 取 5ml 上層液體（相當于 0.5g 的樣本）在氮氣 | ||
1、 取 1ml 血清或血漿至試管中，加 2ml 乙酸乙酯 | 流下 50-60℃干燥； |
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| 振蕩 1min；靜置使水相與有機相分層或室溫 | 4、 加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 0.5ml | |
| 4000r/min 離心 5min； | 樣本復(fù)溶液振蕩混合 30s，室溫 4000r/min 以上 | |
2、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮氣流 | 離心 5min；除上層有機相； | ||
| 50℃水浴中干燥；殘留物用 1 ml 樣本復(fù)溶液溶 | 5、 取下層 50 µl 用于分析。 | |
| 解，混合 30s； | 樣本稀釋倍數(shù)： 1 倍 |
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3、 取 50 µl 下層相用于分析。 | （f）牛奶樣本處理方法一 |
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| 樣本稀釋倍數(shù): 1 倍 | 1、 將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處 | |
（c） 尿液處理方法 | 理，吸除上層脂肪；然后取 5ml 去除脂肪奶樣 | ||
1、 移取 2ml 尿液到離心管中，加 pH4.8 100mM 醋 | 至 50ml 離心管中，加入 150µl C 液出現(xiàn)沉淀， | ||
| 酸鈉緩沖液 0.5ml 混合；加 40µl 葡萄糖苷酸酶 | 短暫振蕩后加入 150µl D 液混合； | |
| (Merck,Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在 37℃ | 2、 15℃4000r/min 以上離心 10min，移取上層液； | |
| 水解至少 2 小時（或過夜）； | 用樣本復(fù)溶液以等體積稀釋上層液，混合 30s； | |
2、 該溶液恢復(fù)至室溫后加入 8ml 乙酸乙酯混合 | 3、 取 50µl 用于分析。 |
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| 1min；室溫 4000r/min 離心 10min，取出 4ml | 注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。 | |
| 上層液體在氮氣下 50～60℃干燥； | 樣本稀釋倍數(shù)：2 |
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3、 用 1ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合 | 檢測下限：0.1ppb | 定量下限：0.15ppb | |
| 30s； | （g）牛奶樣本處理方法二 |
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4、 取 50µl 用于分析。 | 1、 將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處 | ||
| 樣本稀釋倍數(shù): 1 倍 | 理，吸除上層脂肪；然后取 5ml 去除脂肪奶樣 | |
（d）蜂蜜處理方法 | 至 50ml 離心管中，加入 250µl C 液和 250µl D | ||
1、 取 2±0.05 g 蜂蜜，放入離心管中，用 4ml 去離 | 液*混合，4-12℃4000r/min 以上離心 10min。 | ||
| 子水溶解；加入 4ml 乙酸乙酯振蕩 2min，室溫 | 如無冷凍離心機，將樣本置冰箱中冷卻到 8℃； | |
| 4000r/min 以上離心 10min； | 2、 轉(zhuǎn)移出 2.2ml 上層液（相當于 2ml 奶樣）至新 | |
2、 移取 2ml 上層清澈液到另一離心管中，50-60℃ | 的離心管中，加入 4ml 乙酸乙酯上振蕩 2min； | ||
室溫（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min ； 3、 吸取2ml 乙酸乙酯上層液體（相當于1ml 奶樣），
50-60℃氮氣流下*干燥；用 0.5ml 樣本復(fù)溶 液溶解干燥的殘留物，混合 30s；
4、 取 50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5
檢測下限：0.025ppb 定量檢測限：0.05ppb
由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾 （在某些 情況下干擾數(shù)值在標準 2 到 3 之間），所以推 薦標準 3 作為陽性結(jié)果的 CUT OFF 判斷值。
（h）奶粉樣本處理方法
1、 稱 2±0.05 g 奶粉至 50ml 離心管中，加入 10ml
去離子水振蕩溶解；加入 1ml C 液和 1ml D 液
*混合；4-12℃4000r/min 以上離心 10min。
若無冷凍離心機，請預(yù)先將樣本冷卻到 8℃；
2、 轉(zhuǎn)移出 3.6ml 上層液（相當于 0.6g 奶粉）至新 的離心管中，加入 6ml 乙酸乙酯振蕩 5min；室 溫（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min；
3、 吸取 4ml 乙酸乙酯上層液體（相當于 0.4g 奶 粉），50-60℃氮氣流下*干燥；用 0.4ml 樣
本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合 30s； 4、 取 50 µl 用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1
檢測下限：0.05ppb 定量檢測限：0.15ppb
由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾 （在某些情
況下干擾數(shù)值在標準 2 到 3 之間），所以推薦 標準 3 作為陽性結(jié)果的 CUT OFF 判斷值。
（i）蛋類處理方法
1、 稱取 3±0.05 g 均質(zhì)的樣本，加入 9ml 乙腈-水溶 液振蕩 2min，15℃4000r/min 以上離心 10min；
2、 取 3ml 上層相與 3ml 去離子水水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯，混合 1min，15℃4000r/min 以上離心 10min；取上層有機相置 50-60℃下氮氣 流吹干；
3、 加入 1ml 正己烷溶解殘留物后，用 2ml 樣本復(fù) 溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 5min；
去除上層有機相； 4、 取 50 µl 用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：
| 檢測下限：0.1ppb | 定量檢測限：0.3ppb | 7、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔 | |||||
（j）飼料處理方法 |
| 洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙 | ||||||
1、 稱取 2±0.05g 均質(zhì)過的飼料樣本，加入 2ml 去 | 拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺 | |||||||
| 離子水，再加入 6ml 乙酸乙酯，充分振蕩 2min， | 破）。 |
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| 15℃ 4000r/min 以上離心 10min； | 8、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃ | ||||||
2、 取 3ml 上層有機相到試管中 56℃下氮氣吹干； | 環(huán)境中反應(yīng) 30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌 | |||||||
3、 加入 1ml 正己烷溶解殘留物，用 1ml 樣本復(fù)溶 | 液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水紙拍干（拍 | |||||||
| 液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 5min；去 | 干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。 | ||||||
| 除上層有機相； |
| 9、 顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B | |||||
4、 取 50 µl 用于分析。 |
| 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯 | ||||||
| 樣本稀釋倍數(shù)：1 |
| 色 15min。 |
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六、 酶標免疫分析程序: |
| 10、 測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻， | ||||||
| 設(shè)定酶標儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/63 | |||||||
u | 測定前應(yīng)須知： |
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| 0nm 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。 | |||||||
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 | ||||||||
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| （20～25℃）。 |
| 七、結(jié)果判定 |
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2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。 | 結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方 | |||||||
3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于 | 法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與 | |||||||
| 洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 | 其所含氯霉素量成負相關(guān)。 |
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| 程序中的要點。 |
| 1、粗略判定： |
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4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜 | 用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出 | |||||||
| 蓋住微孔板。 |
| 其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3， | |||||
u | 操作步驟： |
| 樣本 2 的吸光度值為 1.0，標準液吸光度值分別是： | |||||
1、 從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～ | 0ppb 為 2.243；0.05ppb 為 1.816；0.15ppb 為 1.415； | |||||||
| 25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使 | 0.45ppb 為 0.74；1.35ppb 為 0.313；4.05ppb 為 0.155。 | ||||||
| 用前均須搖勻。 |
| 則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2 | |||||
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放 | 的濃度范圍是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應(yīng)的稀 | |||||||
| 入自封袋，保存于 2-8℃。 | 釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。 | ||||||
3、 配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去 | 2、定量分析 |
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| 離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份 | （1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分 | ||||||
| 去離子水），或按所需用量配制洗滌液。 | 吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙 | ||||||
4、 編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每 | 孔）除以第-個標準（0 標準）的吸光度值，再乘 | |||||||
| 個樣本和標準品做 2 孔平行，并記錄標準孔和 | 以 100%，即 |
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| 樣本孔所在的位置。 |
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| B |
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5、 將濃縮抗體用樣本復(fù)溶液 11 倍稀釋（1 份抗體 | 百分吸光率（%）＝ | ×100% | ||||||
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| 加入 10 份稀釋液，按需配制使用） | B0 |
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| B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 |
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| 6、 加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加 |
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| B0—0ng/ml 標準溶液的平均吸光度值 |
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| 加入抗體工作液 50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕 |
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| （2）標準曲線的繪制與計算 |
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| 振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。 |
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| 以標準品百分吸光率為縱坐標，以氯霉素標準 |
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品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線 圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準 曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋 倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于 大量樣本的準確、快速分析。
八、 注意事項
1、 室溫低于 25℃或試劑及標本未回到室溫（20～
25℃）會導(dǎo)致所有標準的 OD 值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會 伴隨著標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。 所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜 使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用 不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質(zhì) 和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴 露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。標 準品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能 變質(zhì)。
8、 該試劑盒Z佳反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過高或過 低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。
2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見 包裝盒。
提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正 常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
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