過氧化物酶(Peroxidase,POD)試劑盒說明書
可見分光光度法
試劑的組成:
提取液:液體60mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體60mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:液體×2瓶,4℃保存;用時每瓶加入5mL試劑一;用不完的試劑4℃保存一周;
試劑三:液體10 mL×1瓶,4℃保存。
測定意義:
POD(EC 1.11.1.7)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物,具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。POD催化H2O2氧化特定底物,在470nm有特征光吸收。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水
操作步驟:
細菌或培養(yǎng)細胞:先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
試劑名稱(µL) | 測定孔 |
樣本 | 15 |
蒸餾水 | 270 |
試劑一 | 520 |
試劑二 | 130 |
試劑三 | 135 |
測定前將試劑一、二和三37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)放置10min。在1mL玻璃比色皿中按順序加入上述試劑,立即混勻并計時,記錄470nm下30s時的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。計算ΔA=A2-A1。
注意:
三、POD活性計算:
單位定義:每mL血清(漿)在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。
計算公式:POD(U/mL)=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =7133×ΔA
單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。
POD(U/mg prot)=ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.01÷T =7133×ΔA÷Cpr
單位定義:每g組織在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。
POD(U/g 鮮重)=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =7133×ΔA÷W
單位定義:每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中每分鐘A470變化0.01為一個酶活力單位。
POD(U/104 cell)=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T =14.27×ΔA
V反總:反應體系總體積,1.07mL; V樣:加入樣本體積,0.015mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量;500:細菌或細胞總數(shù),500萬。
實驗代做服務:
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