DH5α 感受態(tài)細(xì)胞

儲(chǔ)存條件：-70℃保存，避免反復(fù)凍融。

組成 YBC102-01 BC102-02

DH5α Competent cells 10×100µl 20×100µl pUC19（0.1ng/µl） 5µl 5µl

產(chǎn)品介紹：

本公司生產(chǎn)的 DH5α感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌 DH5α菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細(xì)胞，可用于

DNA 的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用 pUC19 質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá) 108 cfu/µg，-70℃保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。每支感受態(tài)可以酌情分裝使用，降低了實(shí)驗(yàn)的成本。質(zhì)量穩(wěn)定，使用方便，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉。

基因型：

F-φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-,mk+) supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 phoA

產(chǎn)品特點(diǎn)：

一種用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重級(jí)缺陷的抑制型株。其φ80 lacZΔM15  基因的產(chǎn)物可與 pUC

載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選。操作步驟（以下操作均按無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）：

提示

u 感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70℃，不可多次凍融和放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以避免降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

u 進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作時(shí)，應(yīng)根據(jù)相應(yīng)溫度及無(wú)菌條件的要求進(jìn)行。

u 為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可以保留部分連接反應(yīng)液，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到低。

1. 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無(wú)菌預(yù)冷的離心管中，置于冰浴中。

（一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為 50-100μl，可以根據(jù)實(shí)際情況分裝使用。應(yīng)注意所用DNA 體積不要超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。以下實(shí)驗(yàn)以 100μl 感受態(tài)細(xì)胞為例。）

2. 向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的 DNA  ，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，在冰浴中靜置 30 分鐘。

• 將離心管置于 42℃水浴中放置 60 秒，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻 2 分鐘，該過(guò)程不要搖動(dòng)離心管。（此步驟也可將離心管置于室溫進(jìn)行，時(shí)間不需十分準(zhǔn)確，夏季或室溫較高時(shí)，可放置 5-8 分鐘左右；如果室溫較低，可延長(zhǎng)時(shí)間至 8-15 分鐘左右。條件允許建議使用 42℃熱激方法。）

4. 向每個(gè)離心管中加入 500μl 無(wú)菌的 SOC 或 LB 培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于 37℃ 150rpm，搖床振蕩培養(yǎng) 60 分鐘，目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

5. 無(wú)菌條件下，取適量菌液加到含相應(yīng)抗生素的 LB 固體培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌的細(xì)菌涂布器或玻璃珠將細(xì)胞均勻涂開(kāi)。等平板中的液體*吸收后，倒置平板，37℃培養(yǎng) 12-16 小時(shí)。（涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)調(diào)整。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒在 10ng 左右，90mm 平皿涂布 100µl，55mm 平皿涂布 50µl；連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化菌液建議離心后倒掉大部分上清，余 200µl，取 100µl 用于涂布。）

6. 保留剩余的菌液于 4℃冰箱中，視平板上菌落生長(zhǎng)情況決定去留。

（質(zhì)粒快速轉(zhuǎn)化步驟：將步驟 2 的時(shí)間縮短到 5 分鐘，對(duì)于氨芐青霉素抗性的質(zhì)粒，步驟 3 完成后，可直接涂布或劃線于含氨芐青霉素抗性的LB 平板上。其它抗性的質(zhì)粒仍需 60 分鐘的復(fù)蘇培養(yǎng)。）

相關(guān)試劑及培養(yǎng)基的制備方法：

LB 液體培養(yǎng)基：稱(chēng)取 10g，Tryptone，5g Yeast Extract 和 10g NaCl 置于 1L 燒杯中。加入約 800ml 的去離子水，*溶解后用 2mol/L 的 NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 值至 7.0。加去離子水定容至 1L。分裝后，121℃ 高壓滅菌 20 分鐘。

2. SOB 和 SOC 培養(yǎng)基：稱(chēng)取 20g Tryptone，5g Yeast Extract，0.5g NaCl 置于 1L 燒杯中加入約 800ml 的去離子水，*溶解后再補(bǔ)加 10ml 250mM KCl 溶液，滴加 5M NaOH（約 0.2ml）調(diào) pH 值 7.0。加入去離子水將培養(yǎng)基定容至 1L。121℃滅菌 20 分鐘。使用時(shí)加入 5ml 滅菌的 2M MgCl2 溶 （此種培養(yǎng)基稱(chēng)為SOB）。再補(bǔ)加經(jīng) 0.22um 過(guò)濾除菌的 1M 葡萄糖溶液 2ml（此種培養(yǎng)基為 SOC）。

3. 轉(zhuǎn)化復(fù)蘇細(xì)菌用的液體 LB 培養(yǎng)基或SOC 培養(yǎng)基：可以一次高壓 50ml 液體培養(yǎng)基，無(wú)菌狀態(tài)按 1ml 每管分裝于高壓滅菌的 1.5ml 離心管中，裝于自封袋中，凍存于-20℃中，每次用一支?？梢詷O大地避免培養(yǎng)基污染和減少勞動(dòng)量。

4. LB 固體選擇培養(yǎng)基：100ml LB 液體培養(yǎng)基中加入 1.5g 瓊脂粉，搖勻后，121℃高壓滅菌 20 分鐘。冷卻至 50℃左右時(shí)加入相應(yīng)濃度的抗生素（如 AMP 濃度通常為 100ug/ml），混勻后倒在細(xì)菌用的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，等瓊脂凝固后即可使用。

5. IPTG：稱(chēng)量 1.9g IPTG（MW=238.31）充分溶解于 40 ml 滅菌水，濃度為 200mmol/L。用無(wú)菌 0.22μm

過(guò)濾膜過(guò)濾除菌。小份分裝后，-20℃保存。

6. X-gal：用DMF（二甲基甲酰胺）配制成 20mg/ml，小份分裝（1ml/份）后，-20℃避光保存

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