考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書
可見(jiàn)分光光度法
注意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,
確保蛋白濃度在0~1000µg/ml范圍內(nèi)。
測(cè)定意義
樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外,可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。
測(cè)定原理
在酸性溶液中,考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物;該復(fù)合物在595nm處有大吸收峰, 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。該方法靈敏度高,適合微量蛋白質(zhì)分析。
自備儀器和用品
離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制
試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品:液體×1 瓶,4℃保存。
樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取
1. 液體樣品:澄清無(wú)色液體樣品可以直接測(cè)定。
2. 組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10的比例(建議稱取約 0.1g組織,加入1mL提取液(自備,根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即待測(cè)液。(動(dòng)物樣品常常需要稀釋)
3. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間 3min);然后 8000g,4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測(cè)。
測(cè)定操作:
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min,蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管:取1mL玻璃比色皿,加入200μL蒸餾水,1000μL試劑一,混勻后室溫靜置10min,
于595nm比色,10~20min 完成比色,記為A空白管。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管:取1mL玻璃比色皿,加入200μL標(biāo)準(zhǔn)液,1000μL試劑一,混勻后室溫靜置10min,
于595nm比色,10~20min 完成比色,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。
4. 測(cè)定管:取1mL玻璃比色皿,加入200μL待測(cè)液,1000μL試劑一,混勻后室溫靜置10min,
于595nm比色,10~20min完成比色,記為A測(cè)定管。
注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。
計(jì)算公式:
Cpr(µg/mL)= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測(cè)定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)
=50×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)濃度,50μg/mL。
注意事項(xiàng):
1.加考馬斯亮藍(lán)后,在10~20min 內(nèi)吸光值相對(duì)較穩(wěn)定,因此須在10~20min 完成比色。
2.不宜用石英比色皿,可用玻璃或塑料比色皿,測(cè)完成后立即用 95%乙醇沖洗。
3.測(cè)定前用1~2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),確保蛋白濃度在0~1000µg/ml 范圍內(nèi),否則需要做相應(yīng)稀釋,使得稀釋后的結(jié)果在 0~1000µg/ml 范圍內(nèi),然后再乘以稀釋倍數(shù)。