葡萄糖含量試劑盒說明書（測(cè)組織、細(xì)菌或細(xì)胞）

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物，而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物。植物可通過光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動(dòng)物而言，葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組織等的唯yi能源，而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān)。

測(cè)定原理：

葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并產(chǎn)生過氧化氫；過氧化物酶催化過氧化氫氧化

4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在 505 nm 有特征吸收峰。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽和蒸餾水

試劑的組成和配制：

試劑一：0.5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 25ml×1 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 25ml×1 瓶，4℃保存；

葡萄糖提取：

1、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g組織，加入 1mL 蒸餾水），研磨成勻漿，95℃水浴 10 分鐘（蓋緊，防止水分散失），冷卻后， 8000g，25℃離心 10min，取上清液備用。

2、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：蒸餾水體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 蒸餾水），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù) 30 次），95℃水浴 10 分鐘（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，8000g，25℃離心 10min，取上清液備用。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm，蒸餾水調(diào)零。

2、混合試劑的配制：使用前將試劑二和試劑三 1:1 等體積混合，用多少配多少。

3、加樣表（在 EP 管中加入下列試劑）：

混勻，置 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴中，保溫 15min，于505nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度?？瞻坠?、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管吸光值分別記為A1、A2 和 A3?？瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

葡萄糖含量計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)=0.5×(A3-A1)÷ (A2-A1)÷Cpr。

2、按樣本鮮重計(jì)算

葡萄糖含量（µmol/g 鮮重）= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)=0.5×(A3-A1)÷ (A2-A1)÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

葡萄糖含量（µmol/ 10⁴ cell)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)=0.001×(A3-A1)÷ (A2-A1)

C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5µmol/mL；V1：加入樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1mL；

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

注意：低檢測(cè)限為 50nmol/g 鮮重或 0.5nmol/mg prot

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