Cell Counting Kit-8,簡稱
CCK-8試劑盒,是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細胞增殖和細胞毒性的快速、高靈敏度、無放射性的比色檢測試劑盒。CCK-8溶液可以直接加入到細胞樣品中,不需要預(yù)配各種成分。WST-8在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細胞增殖越多越快,則顏色越深;細胞毒性越大,則顏色越淺。對于同樣的細胞,顏色的深淺(生成的formazan量)和細胞數(shù)目呈線性關(guān)系
CCK-8試劑盒操作說明
CCK-8試劑盒可以用于細胞因子等誘導(dǎo)的細胞增殖檢測,也可以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導(dǎo)的細胞毒性檢測,或一些藥物誘導(dǎo)的細胞生長抑制檢測。
1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
a.先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量,然后接種細胞;
b.按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度,一般要做5-7個細胞濃度梯度,每組4-6個復(fù)孔;
c.接種后培養(yǎng)2-4小時使細胞貼壁,然后每100霯培養(yǎng)基加10霯 CCK-8試劑培養(yǎng)一定時間后測定OD值,制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量。使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是試驗條件*一致。
2.細胞活性檢測
a.在96孔板中接種細胞懸液(100霯/孔),將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時;
b.向每孔加入10霯的CCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡);
c.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時;
d.用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。
3.細胞增殖-毒性檢測
a.在96孔板中接種細胞懸液(100霯/孔),將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時;
b.向培養(yǎng)板加入不同濃度的待測藥物;
c.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r間;
d.向每孔加入10霯的CCK-8溶液(注意不要產(chǎn)生氣泡);
e.將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時;
f.用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。
CCK-8試劑盒注意事項
1.CCK-8的培養(yǎng)時間一般為1-4小時,但在培養(yǎng)30分鐘左右即可取出肉眼觀察顯色程度,根據(jù)細胞種類而定,需要摸索條件,CCK-8的*佳反應(yīng)時間以具體顯色的*佳時間為準(zhǔn)。
2.使用96孔板進行檢測時,如果細胞培養(yǎng)時間較長,一定要注意蒸發(fā)問題。一方面,由于96孔板周圍一圈*容易蒸發(fā),可以采取棄用周圍一圈的辦法,改加相同量的PBS、水或培養(yǎng)液;另一方面,可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方,以緩解蒸發(fā)。
3.本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應(yīng),所以還原劑(例如一些抗氧化劑)會干擾檢測,如果待檢測體系中存在較多的還原劑,需設(shè)法去除。用酶標(biāo)儀檢測前需確保每個孔內(nèi)沒有氣泡,否則會干擾測定。
4.加入藥物中如含有金屬,對CCK-8顯色有影響。終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng),使靈敏度降低。如果終濃度是10 mM的話,將會100%抑制。
5.培養(yǎng)基中的酚紅不會影響實驗結(jié)果,酚紅的吸光度可以在計算時,通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不會對檢測造成影響。
6.本產(chǎn)品可以檢測,但不能檢測酵母細胞。向100霯培養(yǎng)液中加入10霯 CCK-8溶液,并培養(yǎng)1-4小時或過夜。
7.CCK-8試劑盒對細胞的毒性非常低。它和活細胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應(yīng)使溶液顏色不斷加深,OD值不斷增加(注:活細胞內(nèi)的脫氫酶是持續(xù)產(chǎn)生的)。
8.要測定細胞的具體數(shù)量,建議同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9.建議采用多通道移液器,以減小平行孔間的差異。
10.以下方法可以終止CCK-8反應(yīng)(96孔板):
(a).在顯色反應(yīng)后,將培養(yǎng)板放置4°C冰箱內(nèi)
(b).每孔加10霯 0.1 M HCl溶液
(c).每孔加10霯 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液
CCK-8試劑盒注意:反應(yīng)停止后,應(yīng)在24小時內(nèi)測定。
11.本產(chǎn)品于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品。
12.為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。