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大鼠3-羥3-甲基戊二酰輔酶A (HMGCoA)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)
點擊次數(shù):1631 更新時間:2011-01-18

大鼠3-羥3-甲基戊二酰輔酶A (HMGCoA)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用目的:本試劑盒用于測定大鼠血清,血漿,組織及相關(guān)液體樣本中3-羥3-甲基戊二酰輔酶 A (HMGCoA)的含量。實驗原理:
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中大鼠3-羥3-甲基戊二酰輔酶A (HMGCoA)水平。用純化的大鼠3-羥3-甲基戊二酰輔酶 A (HMG CoA)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入3-羥3-甲基戊二酰輔酶 A (HMG CoA),再與 HRP標記的3-羥 3¬甲基戊二酰輔酶 A (HMGCoA)抗體結(jié)合,形成抗體 -抗原-酶標抗體復合物,經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的3-羥3-甲基戊二酰輔酶 A (HMGCoA)正相關(guān)。用酶標儀在 450nm波長下測定吸光度( OD值),通過標準曲線計算樣品中大鼠3-羥3-甲基戊二酰輔酶 A (HMGCoA)濃度。試劑盒組成:

樣本處理及要求:

1. 血清:室溫血液自然凝固 10-20分鐘,離心 20分鐘左右( 2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇 EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合 10-20分鐘后,離心 20分鐘左右( 2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。

3. 尿液:用無菌管收集,離心 20分鐘左右( 2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心 20分鐘左右( 2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,用 PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞
濃度達到 100萬/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心 20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的 PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于 -20℃保存,但應(yīng)避免反復凍融 .

7.  不能檢測含 NaN3的樣品,因 NaN3抑制辣根過氧化物酶的( HRP)活性。

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設(shè)標準品孔 10孔,在*、第二孔中分別加標準品 100μl,然后在*、第二孔中加標準品稀釋液 50μl,混勻;然后從*孔、第二孔中各取 100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液 50μl,混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl棄掉,再各取 50μl分別加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液 50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各取 50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50μl,混勻后從第七、第八孔中分別取 50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標準品稀釋液 50μl,混勻后從第九第十孔中各取 50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為 50μl,濃度分別為 18 0 ng/L,120 ng/L,60 ng/L,3 0 ng/L, 15 ng/L)。

2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl,然后再加待測樣品 10μl(樣品zui終稀釋度為 5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

3. 溫育:用封板膜封板后置 37℃溫育3 0分鐘。

4. 配液:將 30(48T的 20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30(48T的 20倍)倍稀釋后備用。

5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30秒后棄去,如此重復 5次,拍干。

6. 加酶:每孔加入酶標試劑 50μl,空白孔除外。

7. 溫育:操作同 3。

8. 洗滌:操作同 5。

9. 顯色:每孔先加入顯色劑 A50μl,再加入顯色劑 B50μl,輕輕震蕩混勻, 37℃避光顯色15分鐘.

10. 終止:每孔加終止液 50μl,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

11. 測定:以空白空調(diào)零, 450nm波長依序測量各孔的吸光度( OD值)。測定應(yīng)在加終止液后 15分鐘以內(nèi)進行。

注意事項:

1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。
3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在 5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
4.請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高(樣本 OD值大于標準品孔*孔的 OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)( n倍)后再測定,計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物請避光保存。
7.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準 .
8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9.本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異,以英文說明書為準。
計算:以標準物的濃度為橫坐標, OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的 OD 值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與 OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的 OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。
 
(此圖僅供參考)
試劑盒性能:
1. 樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù) R值為 0.95以上。
2. 批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于 9%和 11%

檢測范圍:
4 ng/L -250 ng/L
保存條件及有效期:
1 2-8℃。
2 6個月


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